质粒DNA的提取_原创文档.pdfVIP

实验一质粒DNA的提取

[实验目的]

通过本实验掌握碱裂解法提取质粒。

[实验原理]

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差

异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开

而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补

链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至

中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，

而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们

缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合

物等一起沉淀下来而被除去。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器

1、恒温培养箱

2、恒温摇床

3、台式离心机

4、高压灭菌锅

（二）材料

1.葡萄糖

2.三羟甲基氨基甲烷（Tris）

3.乙二胺四乙酸（EDTA）

4.氢氧化钠

5.十二烷基硫酸钠（SDS）

6.乙酸钾

7.冰乙酸

8.乙醇

9.盐酸（HCl）

10.Bt菌株

11.吸头、小指管

（三）试剂

1、溶液I

50mmol/L葡萄糖

5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl

10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

2、溶液II

0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合

3、溶液III

5mol/L乙酸钾60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

4、TE缓冲液

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA(pH8.0)

5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

[实验步骤]

（一）提取质粒

1、将Bt菌株接种于LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。

2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。

3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

5、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf

管放在冰上。

6、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。

7、12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中。

8、向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。12000r/min离心5min。

倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

9、用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气

中干燥。

10、50μLTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

[实验安排]

本实验一天内可做完。实验结果可结合下一个实验一起观察。

实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA

[实验目的]

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法。

[实验原理]

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点

的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相

同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小

和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离