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第十九章遗传代谢性疾病的基因诊断

“十一五”规划教材全国高等医药教材建设研究会规划教材

第十九章遗传代谢性疾病

的基因诊断

第三军医大学府伟灵黄庆

主要内容

前言

一、基因诊断技术

二、遗传代谢性疾病的基因诊断

前言

●细胞、组织、器官和机体的生存与功能维持都必须

依赖不断进行的物质代谢过程。

●物质代谢包括合成代谢及分解代谢两个过程。

●代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱，多为酶或蛋白

异常所致。

●根据代谢性疾病的病因，可将其分为原发性和继发

性。

一、代谢性疾病的分类

二、代谢性疾病的诊断手段

一、代谢性疾病的分类

原发性代谢性疾病：

又叫先天性代谢性疾病。是指当编码物质代谢所需酶或蛋白的基因发生突变、不能合成或合成了无活

性的产物时，就会导致有关代谢途径不能正常运转，

造成具有不同临床表型的各种代谢缺陷病。

继发性代谢性疾病：

继发性代谢性疾病是由其它原发性疾病导致的代谢性疾病，如糖尿病导致的继发性高脂血症。

二、代谢性疾病的诊断手段

●过去：主要依靠与物质代谢相关的各种酶的

生物化学方面的诊断

●现在：生化诊断+基因诊断

基因诊断的概念

基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的

技术方法,直接检测基因结

构及其表达水平是否正常,

从而对疾病作出诊断的方法。

基因诊断的特点

●针对性强

●特异性高

●灵敏度高

●适用性强

●诊断范围广

第一节基因诊断技术

一.DNA测序技术

二.聚合酶链反应技术

三.毛细管电泳技术

四.基因芯片技术

一、DNA测序技术

所有生物基因组序列的数据均来自DNA测序

特点:

●稳定简便

●自动化程度高

●数据准确可靠

●公认为国际金标准

双脱氧链终止法

原理:

●测序基础是以ddNTP为

测序反应的链终止剂

●掺入到延伸链中的

ddNTP可阻止后续ddNTP

或dNTP的掺入

示例：BigDye?Terminators

●循环测序反应扩增到未端为BigDye?Terminators的

一系列的核苷酸链。

●循环测序反应产物经沉淀、洗涤和纯化，从而去除多

余的未反应的BigDye?Terminators。

●电泳与结果分析。

焦磷酸测序技术

原理:

引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种酶

的协同作用下，将每一个dNTP的聚合与一次荧光信

号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，

以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷酸序列。

AB

DNAPolymeraseACCTTGAATTCGTCCTAGGA……

GGATCTT……

dNTPApyrase

(d)NMP

PPi

ATP

ATP-sulphurylase

Luciferase

Light

CTGC

TTAA

AGTCAGTCAGTCAGTC

基本流程：第1步

一个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、

Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和

Luciferin)。

基本流程：第2步

向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。

聚合酶

(DNA)n+dNTP(DNA)n+1+PPi

基本流程：第3步

在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值高低则和相匹配的碱基数成正比。

基本流程：第4步

反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。

dNTPdNDP+dNMP+Pi

ATPADP+AMP+Pi

ATP双磷酸酶ATP双磷酸酶