基因组学理论课 4-5genetics.pptVIP

生物信息与数据处理第三节基因组分析策略和技术1克隆克隆（cloning）：涉及将特定DNA片段插入类似于染色体的载体（vector）中，载体使它们能在活细胞内进行复制。由于所有片段的拷贝都是相同的，所以叫分子克隆（molecularclone），这些片段可纯化并可直接用于研究或储存在文库中以便进一步分析。基因文库（geneticlibrary）：所有克隆到载体上的基因的集合形成基因文库（geneticlibrary）。一个理想的基因文库应包括一个生物体DNA中每个片段的拷贝。基因组等价物（geneticequivalent）在这样一个完整的基因组文库中克隆的数目（用基因组的大小除以平均片段长度）称为基因组等价物（geneticequivalent）。克隆过程的随机性使某些片段将被克隆多次而另一些可能在基因组等价物中并不出现。增加基因组文库中克隆的数量将增加任一给定DNA片段都至少含有其一个拷贝的可能性。具有4个或5个基因组等价物的文库平均每个DNA片段有4或5个拷贝，基因组任一特定部分有至少一个拷贝的可能性为95%。3cDNA文库（cDNAlibrary）所有蛋白编码区域共有的特征是它们被核糖体翻译之前全转化成mRNA。逆转录酶（reversetranscriptase）将mRNA转化成互补DNA（cDNA），然后克隆成为文库。由于细胞通常只转录具有重要功能的基因的mRNA，所以展示cDNA文库往往可以抓住基因组的关键部分。在任一类型的器官或细胞文库中，cDNA的相对丰度可以指示一个特定基因的表达量。4聚合酶链反应PolymeraseChainReaction，ＰＣＲ背景知识多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。1985年Kary.Mullis及同事创立。随后借助于热稳定性TaqDNA聚合酶的发现，1987年KaryMullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。1993年度，KaryMullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学奖。PCR反应系统模板DNA：要扩增的基因片段即目的基因一对引物：引导DNA链的合成，“引子”四种三磷酸脱氧核苷：合成DNA链的原料热稳定的DNA聚合酶：催化DNA合成适当的缓冲体系：镁离子等模板DNAPCR反应必须以DNA为模板进行扩增,一般反应中的模板数量为102-105个拷贝对于单拷贝基因,需要0.1μg的人基因组DNA引物两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，一般15－25碱基长ATCGGCTAAGCTATCCGT四种磷酸脱氧核苷酸(dNTP)TaqDNA聚合酶方法三个基本步骤:(1)变性：目的双链DNA片段在94℃下解链(2)退火：两种引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过碱基配对结合(3)延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以目的DNA为模板进行DNA合成由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达100万倍。PCR扩增－－30个循环PCR结果－－

凝胶电泳二DNA序列测定1Sanger双脱氧末端终止法测序原理2双脱氧链终止法对DNA多聚酶的要求高活性无5’－3’外切核酸酶活性无3’－5’外切核酸酶活性klenow多聚酶噬菌体T7编码的“Sequenase”（测序酶）4Solexa测序原理Solexa测序技术属于新一代测序技术（第二代），其核心思想是边合成边测序（sequencingbysynthesisorligation）。即生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。可以在DNA扩增表面读取数千万个32-40bp长的片段。以边合成边测序为标志的新一代测序技术的代表有四种测序平台：Roche(454)GSFLXsequcncerIlluminagenomean