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新手细胞免疫荧光实验常见问题解答--第1页
新手细胞免疫荧光实验常见问题解答
一提到蛋白实验,大家想到最多的就是Westernblot,其实除了
WB,免疫荧光技术也是一项很好的检测蛋白定位和表达的辅助试验。
今天,小六儿想跟大家分享一下自己在做免疫荧光试验的一些经验。
1、细胞密度
细胞密度是整个实验是否能成功的关键点之一。无论是贴壁细胞
还是悬浮细胞,爬片后细胞密度直接影响到后续的荧光拍照效果。
免疫荧光对细胞密度的要求不同于细胞划痕实验。我们在做细胞
划痕的时候,一定要等到细胞长满才可以进行后续操作,但是免疫荧
光并不需要这么多的细胞数量,镜下细胞太多反而会让图像效果很乱,
没有针对性;如果细胞数量太多,产生叠加,也会影响整体荧光效果。
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第一张图可能不是很清楚,玻片四周的细胞较多,中间的细胞较
少。20倍镜下DAPI核染色可见细胞密度较大,其中亮度更显著的地
方很可能是多层细胞叠加的效果。
那么我们该如何控制好细胞爬片时的密度呢?我们需要考虑的到
爬片的尺寸和细胞生长时间。爬片是一个动词,其实就是将玻片放到
培养皿中,让细胞在玻片上生长。
第一点:我们要保证玻片上的细胞以单细胞层生长。
在这一点上,个人认为悬浮细胞很容易被吹打混匀,玻片上的细
胞基本上可以保证处于同一层面。但是贴壁细胞本身很喜欢抱团生长,
所以镜下总是一簇一簇的细胞聚集,这种情况下就很难保证细胞生长
同一层面了。那么我们在做这一步的时候,建议大家用10μl的小枪头
吸取细胞悬液,在25mm的细胞爬片上从玻片外圈向内圈转圈加样
(见下图),这么做相当于在缓慢加样的过程中,玻片上的细胞又完
成了一次从外向内和从内向外的混匀过程,防止某一部位的细胞聚集。
加样结束后,镜下观察细胞初步密度。如果细胞密度过大,可以
将玻片上的细胞悬液吸回再重新稀释;如果细胞密度可以,只是还存
在部分细胞聚集,可以用5ml的注射器针头轻轻拨动细胞悬液,注射
器针头相对于10μl的枪头还是细的,不会破坏细胞形态。
第二点:我们要考虑到细胞生长的速度。
正常细胞放在6cm的培养皿中,可能2-3天才会长满。但是爬片
的面积本身较小,细胞在小面积的爬片上生长速度会更快一些,所以
一般等到爬片上的细胞稳定后,再添加培养基于孵箱内培养12小时就
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可以了。如果时间超过24小时,即使最开始接种密度小,最后也会长
得很满。
第三点:我们要保证爬片是无菌的。
从公司购买的爬片都是经过γ射线灭菌后用锡纸包装的,是可以
直接使用的。使用之前在超净台下照一下紫外就可以了。然而实验中
我们会发现,放置时间较长的爬片会经常黏连,很难分开。造成这种
情况的原因多半是之前使用过的人没有把爬片封存好,接触到空气后,
湿度较大造成的爬片黏连。我们在分离爬片的时候最好选用塑料材质
的镊子(转膜时常用的那种材质),这样的镊子较软,一般不会将爬
片捏碎。每次使用后记得用锡纸包裹好放回专门保存爬片的盒子中。
其实只要保证使用后包裹严密,就不会造成黏连的情况。
2、孵育抗体
IF的抗体和WB的抗体并不都是能通用的,要看具体
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