大肠杆菌不耐热肠毒素LT基因双价植物表达载体构建.doc

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大肠杆菌不耐热肠毒素LT基因双价植物表达载体构建

1大肠杆菌不耐热肠毒素LT基因双价植物表达载体构建大肠杆菌不耐热肠毒素LT基因双价植物表达载体构建;作者：

祝建波史芳芳;王冬梅周鹏毕业论文【关键词】;大肠杆菌;,不耐热毒素LT;,植物疫苗;,载体构建,毕业论文[摘要];目的:构建可高效表达不耐热肠毒素LT的双价植物表达载体。

方法:采用PCR的方法从强致病菌株中K88ac中,分别克隆了LTA和LTB基因,将LTA和LTB基因同时连接到植物表达载体pBI121上。

结果:成功构建了带有内质网滞留信号RDEL/KDEL的不耐热肠毒素A、B亚单位基因双价植物表达载体pCAMBIA2300LTALTB。

结论:构建的双价植物表达载体pCAMBIA2300LTALTB,为研究LT全毒素在植物中的正确组装及进一步构建带有保护性抗原类全毒素嵌合植物疫苗奠定基础。

毕业论文[关键词]大肠杆菌;不耐热毒素LT;植物疫苗;载体构建;添加免疫佐剂是提高免疫反应强度的有效方法,在非植物疫苗中已经被多次证实。

在植物疫苗中,在抗原基因转入的同时加入免疫佐剂的基因,使转基因植物在表达抗2原蛋白的同时也表达免疫佐剂,应是提高转基因植物口服疫苗免疫反应性的可行策略之一[1]。

不耐热肠毒素(heatlabileenterotoxin,LT)是肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenicEcoli,ETEC)分泌的一种热不稳定性肠毒素,由A、B两种亚单位组成的AB5型杂六聚体蛋白,是目前人们发现的最强有力的黏膜免疫原和黏膜免疫佐剂之一。

动物免疫实验证实,LT全毒素分子明显比B亚单位五聚体有更强的免疫原性。

研究发现,单独的LTB与靶抗原同时口服后,佐剂作用不明显,而微量全毒素LT同抗原共同口服后,表现出很强佐剂作用[2]。

当前,对减毒LT在烟草植物叶绿体中的表达已有研究[3],但对大肠杆菌肠毒素LT在植物胞质中的表达还未见报道。

本研究旨在从K88ac强致病菌株中克隆LTA、LTB基因,构建成双价植物高效表达载体,最终通过转基因植物来研究其在植物胞质中组装成AB5六聚体的效率,为进一步研究类LT全毒素传输疫苗载体打下了基础。

毕业论文1;材料和方法毕业论文1.1;材料;EcoliDH5菌株,pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pBI121及pBLG载体,均为本实验室保存。

限制性内切酶和T4DNA连接酶为宝生物公司产品,TaqDNA聚合酶及pGMTEasy载体等为北京天为时代公司产品。

毕业论文31.2;方法毕业论文1.2.1;LTA、LTB基因的克隆;采用碱裂解法从K88ac菌株中提取质粒。

按照GenBank中的eltA(V00275)和eltB(M17874)的成熟肽LTA、LTB基因序列,采用Primer50引物设计软件,设计相应引物。

引物由上海申工DNA合成部合成。

扩增LTA基因的引物序列,P1为:5GGATCCATGCTCGAGAATGGCGACAGATTATAC3,P2为:5GAGCTCTTATAATTCATCCCGGATTCTGT3;扩增LTB基因的引物序列,P3为:5CTCGAGATGAATAAAGTAAAATGTTATG3,P4为:5GTCGACTTATAGTTCATCTTTGTTTTTCATACTGATTGC3。

为了方便构建植物表达载体,在扩增LTA基因序列的上游5端引物设计中,引入了BamHI酶切位点,在下游5端引入SacI酶切位点,并将LTA基因的终止密码子突变为（TGATAA）。

同时,按同义密码子将LTA基因末端的EcoRI酶切位点进行了AG突变(见引物G)。

在扩增LTB基因序列的上游5端引物引入了XhoI酶切位点,在下游5端引入SalI酶切位点,并将LTB基因的终止密码子进行突变（TAGTAA）。

扩增LTA及LTB基因的反应体系为:10buffer2L、25mmol