蛋白质印迹法.docVIP

蛋白印迹法〔Western-blot〕

一、根本原理

细胞色素P450是一组含亚铁血红素，构造与功能相关的超家族基因编码的同工酶，因复原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450nm处有一特异吸收峰而得名。的细胞色素P450超家族中，主要有CYP1、CYP2、CYP3三个基因家族，是生物体参与内外源性化合物生物转化酶系的主要成员，并与肿瘤的发生密切有关。其中CYP1家族中的CYP1A1与多种前致癌物、致突变物的代谢活化及肿瘤的开展密切相关，所以对CYP1A1的研究有重要的意义。

本实验采用蛋白免疫印迹〔westernblotting,WB〕技术分析小鼠肝，肾两个器官中的CYP1A1的含量。WB的原理如下。

Westernblotting常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳〔SDS—PAGE〕法别离蛋白质。SDS是一种阴离子去污剂，它能与绝大多数蛋白质结合。无论与SDS结合前蛋白质的等电点是多少，结合后蛋白质将带上等量的负电荷，通常SDS与蛋白质结合的比例为1.4：1g。同时结合后蛋白质的分子构象发生改变，行成长椭圆棒状，其短轴大约为18nm,其长轴与分子量有关〔一定范围内成正比〕，此时蛋白质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。另外，SDS—PAGE过程中还参加了二硫苏糖醇和?-巯基乙醇等强复原剂，破坏二硫键使得蛋白质的原有空间构造充分破坏，因此SDS—PAGE能将不同分子量的蛋白质别离开。

别离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体上〔如硝酸纤维素膜〕。用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为结实，不易被后续的洗膜等操作洗脱.

Westernblotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体〔简称一抗〕，通常由于较难大量获得该抗体，使得对其进展标记很困难。为此人们设计了能与一抗结合的抗体，成为第二抗体〔简称二抗〕。二抗是将一抗的FC段作为抗原的，而每一物种的抗体FC段氨基酸序列都较为保守，这使得二抗能够大量生产，因而对二抗进展标记也就较为容易了。二抗与一抗能通过抗原抗体特异性结合后，以一定的方法对二抗上的标记进展检测便可检出靶蛋白。

二、器材

电热水浴箱、玻璃匀浆器、冷冻离心机、滤纸、水平摇床、电转移装置、醋酸纤维素膜〔NC膜〕、电泳仪、试管、微量移液器、Tip头、Epp管〔2ml、5ml、1.5ml〕

三、试剂配制：

1〕、Tris—Hcl,pH8.8：Tris溶于60mlddH2O，用浓盐酸调节PH至8.8，定容至100ml，4℃保存。

2〕、MTris—Hcl,pH6.8：Tris溶于60mlddH2O，用浓盐酸调节PH至6.8，定容至100ml，4℃保存。

3)、10％SDS：10g

4〕、10×TBS〔Trisbuffersolution〕,pH7.6：Tris，80gNaCl,溶于700mlddH2O用1MHCl〔约15ml〕调节pH至7.6，加ddH2O至1000ml。

5〕、TBS-T，pH7.6：前述TBS-T加Tween-20使浓度为0.1％。

6〕、5×电泳缓冲液，pH8.3：15gTris,72g甘氨酸，5gSDS溶于1000mlddH2O，4

7〕、转移缓冲液〔25mMTris、192mM甘氨酸、20％甲醇〕，pH8.3：3.03gTris，

8〕、10mMPMSF液；异丙醇8ml，PMSF0.01742g

9〕、裂解缓冲掖；包含50mmol/LTris.HCl(Ph8.0),150mmol/LNaCl,1％TritonX:配置100ml的裂解缓冲掖，需称取Tris碱g溶解于60ml双蒸水，用浓盐酸调节Ph8.0，然后参加NaCl,TritonX—1001ml,加水至总量为100ml。

10〕、PBS800ml蒸馏水中参加NaCl18g，KCl,Na2HPO4和KH2PO4,用浓盐酸调节Ph至7.4，定容至1L。高压灭菌。

11〕、10％过硫酸胺〔APS〕：称取APSg溶解于5mlddH2O中，分装保存于—20℃

12〕、1％溴酚蓝:称取0.1g溴酚蓝溶解于10mlddH2O中,分装保存于4℃

13〕30%丙烯酰胺〔Acr:Bis=29:1〕:称取丙烯酰胺〔Acr〕29g,甲叉丙烯酰胺〔Bis〕1g,用去离子水溶解并稀释至100ml,储存在棕色瓶中于4℃

13〕、SampleBuffer:

总体积8.0ml

ddH2O3.8ml