StageTips®微柱纯化与预分离应用手册.pdf

StageTips®应用手册

StageTips是一种微柱，用于多肽和蛋白质样品的方便、安全和灵敏的纯化或预分离。StageTips作为

一次性聚丙烯枪头，适合标准加样枪和大多数商业自动化系统。微柱自身带有PTFE材料支持着密实的色

谱填料颗粒。根据实际需要，可以选择常见的C18,C8和强阳离子色谱填料。StageTips有几种规格，包括

不同的枪头形状、柱体积和化学特性。

使用：

通常，我们建议从柱的上部(即枪头的大头)加入缓冲液和样品，液体通过空气压力施压使柱中的液体

流下。用随StageTips一起购买的2.5mLEppendorfCombitip可以方便的产生空气压力。与顶部加样方法相

反，你也可以用StageTips轻微抽取真空通过枪头的尖头吸取缓冲液。但是如果采用这种方法，我们建议

施加真空要保持液体流动的最小要求，因为柱填料没有固定在枪头内部，有可能会因压力过大使填料活

动。

样品通过一步流程已经被有效地留在柱中，但你可以容易地通过液体在柱中的反向流动做到二步或

三步流程。

注：最小的StageTips(C18填料)样品载量大约为3μg蛋白质或多肽(这相当于50picomol的BSA片断)。

如果你需要纯化更高的样品量，要确信用更大的规格。

StageTips是Rappsilber,Ishihama和Mann首先发明和描述的(Anal.Chem.2003,75,663-670).这篇优秀

论文全面论述了在蛋白质研究领域中和应用和优点，你可以在此找到更多的信息。

C8或C18StageTips纯化方案：

1.用10μL50%甲醇/5%甲酸活化柱子。

2.用10μL5%甲酸平衡柱子。

3.从酸化水性缓冲液(类似于平衡缓冲液)中，将蛋白质或多肽加入柱中。

4.用20μL5%甲酸冲洗柱子和样品。

5.按以下步骤洗脱样品：

-用于纳升级电喷雾：

用1.5μL50%甲醇/5%甲酸洗脱。

直接洗脱至nanoES电喷针，并将洗脱液摇晃或旋转至电喷针针尖。

-用于MALDIMS:

用1μL基体溶液(例如：饱和4-羟基-3-氰基-肉桂酸的70%acetonitrile/0.1%TFA)洗脱。洗脱并直接滴加到

MALDI样品台上。

-用于LC-MS和其它用途:

用5μL50%甲醇/5%甲酸洗脱。

洗脱至微滴板或试管，留作下面步骤使用。保持样品冷却。

在使用强阳离子交换StageTips之前：

1.用10-30μL50%甲醇/5%甲酸预活化SCXStageTips。

2.用2x10-30μL盐溶液活化SCXStageTips(活化最好1小时)。

推荐盐溶液是0.2M磷酸钾+0.3M醋酸钾。

3.活化后用10-30μL水冲洗。

4.用纯化方案中使用到的最大浓度的B缓冲液2x10-30μL平衡SCXStageTips(平衡最好1小时).

5.随后，用10-30μL水冲洗3次。

新的SCXStageTips有时会以不希望的方式吸附少量的蛋白质。这种问题可以在样品纯化前通过用稀释廉价的多

肽混合物“饱和”SCX填料来克服。我们建议，用最大浓度的B缓冲液洗脱混合物，然后在加入真正的样品前用10-30

μL水冲洗StageTips。

注：总是要用新配制的缓冲液和溶液。

SCXStageTips纯化方案：

A缓冲液：5-25%甲醇/5mMKH2PO4,pH3

B缓冲液：5-25%甲醇/5mMKH2PO4/200-600KCl,pH3

1.用10μL的A缓冲液冲洗SCXStageTips

2.在pH2.5-3.5下加入样品。

3.用10μL的A缓冲液冲洗

4.用10μL的B缓冲液洗脱:

-对于纯化洗脱，要用600mMKCI的B缓冲液一次

-对于分段洗脱，要用200-600mMKCI的B缓冲液几次

对于质谱分析，我们建议用C18StageTips除掉盐(参见上述方案).

如