蛋白质分分离纯化和表征.ppt

此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。离子交换：第32页,共41页，星期六，2024年，5月第33页,共41页，星期六，2024年，5月（六）亲和层析亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。抗原和抗体激素和受体蛋白凝集素和糖蛋白第34页,共41页，星期六，2024年，5月配体蛋白质蛋白质和配体复合物交联试剂载体配体载体与配体交联体杂质杂质游离配体第35页,共41页，星期六，2024年，5月七、蛋白质的含量测定与纯度测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。（一）蛋白质的含量测定第36页,共41页，星期六，2024年，5月1.双缩脲法双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键，凡具两个以上肽键的物质均会发生双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质可以与Gu2＋形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关。第37页,共41页，星期六，2024年，5月2.福林－酚法福林－酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜形成复合物，此复合物以及芳香族氛基酸残基可以还原酚试剂而产生蓝色，再与标准蛋白质(通常采用牛血清白蛋内)比色定量。福林—酚试剂法灵敏度高，但是如果样品和标准蛋白质的芳香族氨基酸差异较大时，会有较大的系统误差。第38页,共41页，星期六，2024年，5月3.紫外吸收法蛋白质组成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，故可用280nm波长的光吸收即光密度的大小来测定一般蛋白质的含量。第39页,共41页，星期六，2024年，5月4.考马氏亮蓝法考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。本法试剂配制简单，操作简便，是一种常见的蛋白质快速微量测定方法。

第40页,共41页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第41页,共41页，星期六，2024年，5月关于蛋白质分分离纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，则解离情况相反。第2页,共41页，星期六，2024年，5月等电点（pI）:在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一pH称为该蛋白质的等电点（pI）。几种蛋白质等电点第3页,共41页，星期六，2024年，5月等电pH并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。等离子点(isoionicpiont):蛋白质在纯水溶液中的带电状态则没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。第4页,共41页，星期六，2024年，5月二、蛋白质的分子大小与分子量的测定蛋白质的分子量的范围：6×103～1×106Da。第5页,共41页，星期六，2024年，5月（一）根据化学组成测定最低相对分子量用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%,计算二者的相对分子质量。最低相对分子量＝x100=铁的百分含量铁的原子量0.33555.8x100=16