内分泌干扰物检测 转基因斑马鱼法.pdf

内分泌干扰物检测转基因斑马鱼法

1范围

本文件规定了利用转基因斑马鱼检测内分泌干扰物的方法。

本文件不适用于检测不能溶解、乳化或制备成均匀分散的悬浮液的受试样品。

本文件不适用于自身产生绿色荧光的受试样品。

2规范性引用文件

GB/T39649实验动物实验鱼质量控制

GB/T21807化学品鱼类胚胎和卵黄囊仔鱼阶段的短期毒性试验术语和定义试验溶液

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1斑马鱼Zebrafish

脊椎动物，生物分类学上属于脊椎动物门、硬骨鱼纲、鲤鱼目、鲤科、斑马鱼

属、斑马鱼种，可用于教学和科研的模式动物。

3.2受精后天数Day(s)Post-fertilization，dpf

受精卵受精后的天数。

3.3无可观察效应浓度NoObservedToxicEffectConcentration，NOEC

与对照组相比，对试验生物未产生明显毒性效应的最高受试样品浓度。

4方法原理

在雌激素作用下，雌激素受体（Estrogenreceptor，ER）ERs的基因在肝脏中的表达会

明显上调。因此，ERs的基因可以作为生物体内雌激素活性检测的典型生物标志物。本方

法使用的雌激素斑马鱼的构建是以UAS-GFF基因表达调控系统为基础，利用优化重组的雌

激素响应元件（ERE）驱动上游质粒GFF的表达，进而对下游UAS质粒中荧光基因eGFP表

达进行调控。类雌激素物质能刺激5×ERE响应，激活GFF的表达，而GFF蛋白可与UAS结

合，进而驱动绿色荧光蛋白（EGFP）的表达，从而达到方便、直观、动态检测环境类雌激

素物质是否存在及其浓度的目的。

5试剂和材料

5.13-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐（CHNO.CHOS，简称MESAB）

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1

将MESAB与NaHPO·12HO以1:5的总质量比混合，配制成4mg/mL溶液，放

242

置在4℃储存。使用时用标准稀释水进行稀释，终浓度为0.16mg/mL。

5.2甲基纤维素

甲基纤维素用超纯水配制成体积分数为3%的液体胶状物：将甲基纤维素缓慢加入

沸水中，边加边搅拌，甲基纤维素完全溶解后，继续搅拌至冷却到室温；用锡箔纸密

封烧杯口，放置在4℃储存。

5.3标准稀释水

配制方法见附录A。

5.4阳性对照药

雌二醇用二甲基亚砜配制成1.00mg/mL溶液，振荡混匀，使用时终浓度为5.00

ng/mL。

6仪器设备

6.1生化培养箱

带有温控和进风装置，温度控制范围5℃~50℃，精度±0.1℃。

6.2电子天平

分度值为0.0001g。

6.3水质检测设备

盐度计（电导率测定仪）、硬度计、pH计、溶解氧测定仪。

6.4体视显微镜

6.5体视荧光显微镜

需配有绿色荧光通道。

7试验准备

7.1斑马鱼准备

按照GB/T39649的规定执行斑马鱼质量控制。

使用转基因雌激素Tg（5xERE:GFF;UAS:EGFP）荧光斑马鱼品系。

在体视显微镜下挑选每孔30尾发育正常且发育阶段一致的4dpf斑马鱼，置于3mL烧杯

中进行孵育，水温控制在26-28.5℃。斑马鱼典型图见附录B。

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7.2受试样品信息确认

应从受试样品提供方获得如下样品信息：

受试样品的名称、批号、规格、数量、包装、颜色性状、主要质量标志物及含量（如

有）、保存条件、有效期、申请单位名称、理化性质、功能主治等信息。

a）受试样品为单体成分时，还应提供相应的化学信息，包括：结构式、分子量、纯

度等。

b）受试样品的助溶剂信息，在助溶剂中的溶解度，在水中、光中、实验条件下的稳

定性，pH。

c）整个周期所用受试样品批号应一致。

7.3受试样品前处理

7.3.1参考表1的方法对不同类型受试样品进行前处理。

表1不