土壤酶的测定方法.docVIP

一、脲酶测定(苯酚钠-次氯酸钠比色法)

脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

1、试剂配制：

pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。

10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

标准曲线绘制：分别取0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5mL氮工作液置于25mL刻度试管中，加蒸馏水至10mL，再加2mL苯酚钠溶液和1.5mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容25mL。1h内再分光光度计上于578nm处比色。

管号

1

2

3

4

5

6

7

8

工作液/ml

0

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

苯酚钠/ml

2

2

2

2

2

2

2

2

次氯酸钠/ml

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

蒸馏水定容

25

25

25

25

25

25

25

25

氨态氮量/μg

0

55

15

25

35

45

55

65

A578-1

0

0.054

0.148

0.263

0.339

0.433

0.514

0.569

A578-2

0

0.052

0.159

0.264

0.371

0.422

0.507

0.556

平均

0

0.053

0.154

0.264

0.355

0.428

0.511

0.563

2、操作步骤

（1）称取2.5ｇ土置于25mL刻度试管中,加0.5mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15min;往瓶中加入2.5mL10%尿素液和5mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养3ｈ。

（2）然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。

（3）取滤液0.5mL置于25mL刻度试管中,用蒸馏水稀释至5mL,然后加入2mL苯酚钠溶液,并立即加入1.5mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,

（4）在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

3、结果计算

以3/24小时后1g土壤中NH3－N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）

Ure＝a·V·n/m

式中：a为由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）0.5；n为分取倍数50；m为烘干土重（g）2.5。

注意事项：

每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。

如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。

二.过氧化氢酶测定(紫外分光光度法)

1.试剂配制

a.0.3％过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释

b.1.5N硫酸：取42mL浓硫酸，稀释后定容至500mL

c.0.02N高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO

d.饱和铝钾矾：十二水硫酸铝钾在20℃溶解度为10.84g,30

2.操作步骤

（1）取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL0.3％H2O2溶液（现配）。同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL0.3％过氧化氢溶液，而不加土样。将三角瓶放在振荡机上振荡20min后，迅速加入饱和铝钾矾溶液1mL,6000rad离心15min。取上清液9mL加入盛有1mL1.5N硫酸（以稳定未分解的过氧化氢），摇匀后。溶液在240nm处比色，测定吸光度As。同时做无土对照A0和无机质对照Ak。

3.结果计算

,，

其中，E是土壤过氧化氢酶的活性；

T是单位吸光度相当于过氧化氢的克数，

A0是无土对照，即空白溶液的吸光度，

As是样品溶液的吸光度，

Ak是无基质溶液的吸光度

C是高锰酸钾的浓度，C=0.02mol/L

V是吸取V0mL（10ml