细胞生物学实验-细胞的原代培养.pptVIP

原代培养2017.10.12一、实验原理原代培养是直接从机体获取组织后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。原代培养的方法主要包括组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散成为单细胞。鸡胚（chickembryoorembryonatedegg）对鸡胚的研究可以追溯到古希腊亚里士多德，鸡胚在疫苗的开发和研究中有着不可替代的作用。二、实验目的

1.了解原代细胞培养的一般方法与步骤2.了解鸡胚的基本结构3.巩固无菌操作技术三、实验材料及设备实验动物9至12日龄的鸡胚2.试剂D–Hanks缓冲液、DMEM培养基、血清、抗生素3.仪器超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜4.其它用品：手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯四、实验步骤：将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。在D–Hanks液中按1：100的比例加入双抗。取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋壳。4.用镊子或砂轮在鸡蛋气室位置敲/划一道裂痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。5.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿（或一次性无菌培养皿）中，并用D-Hanks液冲洗鸡胚。6.用无菌眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks液充分洗涤躯干。7.将躯干部置于小平皿盖中。用D–Hanks液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。8.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。9.在胚胎组织碎块中加入1毫升（1滴管）胎牛血清，用滴管吸取组织块，将组织碎块接种到培养瓶内。在培养瓶中放置10-15个组织块，静置3-5min，然后反转培养瓶，使接种组织块的培养瓶面在上。10.向培养瓶中无组织块的一面（下面）加入完全培养基，注意不要冲到组织块。将培养瓶放在37℃、5％CO2培养箱中培养。11.4小时后翻转培养瓶。培养开始的前两天不要晃动培养瓶。两天后在倒置显微镜下观察（第三天见植块附着在培养瓶壁，周围生长出细胞，补充或更换培养液继续培养，并拍照留存结果）。12.待细胞铺满瓶壁后，弃去培养液，用胰酶消化细胞。弃去消化液,待细胞皱缩变圆。13.补加培养液，轻轻将细胞吹打下来，吹打均匀。将培养物吸置离心管内，静置5min。14.上层为单细胞悬液，下层为组织块沉淀。将上层单细胞悬液轻轻吸置另一离心管内,弃组织块。15.以800—1000rpm离心5min，弃上清液。加入培养液，重新悬浮细胞，转移至心得培养瓶中以传代培养。四、注意事项?1.原代培养材料的选择,尽量选取胚胎或幼小的生物体组织或者繁殖能力较强的组织，如肿瘤组织等。2.要注意无菌操作。其要求应高于外科手术。3.如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有粘壁，则细胞不易生长，既使生长也因没有贴在瓶壁上，而无法收集到。思考题如何提高原代细胞培养的成功率？为克服微生物污染应采取那些措施？下次课主要内容：细胞爬片****