生化分离技术与血液制品.ppt

生化分离技术与血液制品;1、生化分离技术的特点;2、生化产品的特点;5)初始物料成分复杂。除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。?

6)生物活性物质的稳定性低。易变质、易失活、易变性，对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。?

7)产品的质量要求高，尤其是药品等。成品青霉素对其强致敏原?–青霉噻唑蛋白必须控制RIA值（放射免疫测定）小于100（1.5×10-6），蛋白类药物（杂质??2%）、重组胰岛素中杂蛋白小于0.01%。;线粒体(双层膜)是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞生命活动所需能量的95%来自线粒体。;细胞器;线粒体;叶绿体;高尔基体;液泡;核糖体是由蛋白质和RNA组成,有附着型的、有游离型的，是生产蛋白质的机器。(氨基酸脱水缩合的反应就在核糖体上进行的);细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。;细胞破碎机理图;不同细胞破碎的难易程度;;高压匀浆法;高压匀浆法（High-pressurehomogenization）

——大规模细胞破碎的常用方法;高压匀浆器;压力(工业生产中常用55～70MPa的压力)

循环操作次数(多次循环的操作方法)

温度

;不宜采用高压匀浆法的微生物：;进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。;卧式;WSK卧式高效全能珠磨机;②影响细胞破碎的因素;其原理可能与空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。;.;影响超生波破碎的因素;超声波应用;将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。;将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。

;使细胞膜结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。;此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而破碎。;酶溶法;（1）酶溶法（EnzymaticLysis）;选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。;缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。

;某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。;如TritonX-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。

其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温等也可使细胞破碎。;处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。;能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。;通用性差；

时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%

有些化学试剂有毒。;细胞破碎效果的检查;1.直接测定法;2.目标产物测定法;3.测定导电率;选择破碎方法时，需要考虑下列因素：;盐析法

盐析法是指在药物溶液中加入大量的无机盐，使某些高分子物质的溶解度降低沉淀析出，而与其他成分分离的方法。

盐析法主要用于蛋白质的分离纯化。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。;蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。;同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同