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室间隔缺损相关基因分析及超声心动图对其诊治的临床应用研究

研究生周蕾

导师陆凤翔

指导小组许迪孔祥清

一、基础研究

室间隔缺损患者室间隔心肌细胞基因表达谱cDNAarray分析及疾病相关基因鉴定

研究意义

先天性心脏病的发生率高达8%-10%，探索如何预防先天性心脏病的发生是心血管病学的一项重要研究内容。

在单独畸形的先天性心脏病中，室间隔缺损最为多见，从婴儿期到学龄儿童，其发病率占先天性心脏病的16%-23%。且对人类生命健康影响大。

尽管人们已熟悉其胚胎形成、病理解剖与病理生理学，但室间隔缺损特别是单发室间隔缺损发生发展的病因和发病机理还很不清楚。

研究现状

早期的研究认为：缺少或异常的血流动力学刺激对先天性心脏病的发生意义重大

但分子生物学家和发育生物学家认为先天性心脏病是一个原发事件，而不是异常血流的结果

从基因角度对先天性心脏病的病因和发病机理研究已经成为当今世界医学界关注的热点

研究方法

研究家族性先天性心脏病：很难找到先天性单发室间隔缺损心脏病家系受到很大限制

通过心脏发育生物学的研究：前提条件是必须事先知道控制不同发育阶段，不同发育部位的心脏发育基因。实验证明MEF2C、GATA、Nkx2.5等转录因子的突变与先天性心脏病的发生有关。

到目前为止，还没有有关单发室间隔缺损发生发展的病因和发病机理的研究报道。

Nkx2.5

属Nk2家族，系果蝇tinman基因的同源基因homeobox-containing，HOX；种系间高度保守近年来倍受关注；基因结构高度保守；

含有调节其下游各种基因的功能区；在GATA4基因的辅助下，Nkx2.5可能直接调控多种与心脏发育相关的基因，如：ANP、MEF2C等，后者在心肌细胞中的过度表达可导致心脏发育异常，并可直接导致心肌细胞凋亡的发生；

在心脏loop过程中发挥重要作用：靶向性导致Nkx2.5基因缺失可致心脏发育停滞与胚胎死亡，提示在心脏发育与形态学变化中有着非常重要的作用。

实验方案

应用cDNA阵列技术，分析室间隔缺损与正常室间隔的心肌细胞基因表达谱

心肌组织标本收集

cDNA阵列分析

实验方案

表达差异基因的功能分析

信号扫描与分析2-3倍表达差异的基因理论上分析；

NorthernBlot或RT-PCR技术筛选出的基因表达差异相应软件分析。

心肌细胞体外培养反义核酸技术观察未知基因对心肌细胞生长发育的作用。

室缺患者及正常人

外周血白细胞

心肌组织

相关基因突变筛查

（如Nkx2.5）

（PCR及其产物测序）

各30例

mRNA表达

（核酸酶保护法）

蛋白质水平

病理切片

（Westernblot）

（TUNEL）

室缺30例；正常5-10例

相关基因

如Nkx2.5

GATA4

ANP

MEF2C

相关

基因

如

Nkx2.5

细胞

凋亡

拟解决的关键问题

获取室间隔缺损者与正常室间隔的心肌细胞基因表达谱；

分析出已知或未知基因的序列，cDNA文库克隆，测得全长cDNA，再进行染色体定位及基因表达功能研究；

鉴定出可能与室间隔缺损发生有关的疾病相关基因。

预期成果

通过心肌细胞cDNA阵列研究,得到室间隔缺损者与正常室间隔的心肌细胞基因表达谱；

寻找差异基因可获得一些未知新基因，进行相关功能研究后有可能获得一些意想不到的研究结果；

筛选出室间隔缺损疾病相关基因。

发表相关文章2－3篇，完成博士论文

可行性分析

实验技术稳定可靠

实验材料有保障

实验室已经建立各种分子生物学技术；并已经常规开展SD大鼠乳鼠心肌细胞培养、以及心肌组织与细胞的病理学分析；

实验设备与经费有保证

研究进度

2003.7－2004.3

实验准备工作、标本收集、完成部分突变筛查

2004.3－2004.9

完成针对先心患者的实验研究

2004.9－2005.1

质粒构建、完成心肌细胞培养方面的实验

2005.1－2005.4

完成所有实验、总结资料、提交论文

二、临床研究

超声心动图在经导管治疗膜部室间隔缺损中的应用价值研究

术前病例筛选

适应症：

左向右分流

VSD缺损小于14mm

无主动脉瓣脱垂及主动脉瓣舒张期反流

VSD距三尖瓣隔瓣或肺动脉瓣的残端超过2mm

伴室间隔膜部瘤形成时，瘤体不影响右室流出道

D-VSDD-VSD-AO

二维超声测值4.88±0.872.94