荷花花粉多糖的提取实验方案(修改).pdfVIP

荷花花粉多糖提取工艺条件的优化

任务一苯酚-硫酸法测定荷花花粉多糖含量方法的研究

一、原理

苯酚-硫酸试剂可与多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应。多糖在浓硫酸的作

用下水解成单糖并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成橙黄色有色化合物，

以葡萄糖为标准品，然后用紫外分光光度计在约490nm处（己糖）测定光吸收值

与糖浓度的线性关系，进而对样品定量，所得的测定结果是以葡萄糖含量计多糖

含量。

二、试剂

浓硫酸：分析纯，95.5％。

80％苯酚：80%苯酚(分析纯重蒸馏试剂)加20%水使之溶解，可置冰箱中避

光长期贮存。

5％苯酚：临用前以80％苯酚配制。

标准葡聚糖(Dextran，瑞典Pharmacia)，或分析纯葡萄糖。

荷花花粉精制多糖溶液的配制：精密称取荷花花粉精制多糖，配成不同浓

度的溶液。

三、荷花花粉多糖的提取

1、工艺流程

荷花花粉→破壁→粉碎→过筛（40目）→脱脂→浸提→过滤→取上清液测定

2、浸提条件：

浸提温度：50℃，浸提时间：3h，料液比：1∶8，浸提次数：2次

四、实验条件的选择

（一）最大吸收波长的选择

吸取2mL的荷花花粉多糖溶液，置于15mL比色管中，加5％苯酚液1．0mL，

迅速滴加浓硫酸5．0mL，振动均匀后放置5min，然后放入沸水浴中加热15min，

迅速冷却至室温。另加蒸馏水2mL，按同样显色操作为空白。用752p-紫外分光

光度计在波长440500范围内测定，确定其最大吸收峰对应的波长。

~

（二）显色条件的选择

1、显色温度

分别吸取2mL的花粉多糖样品溶液，嚣于15mL具塞试管中，加5％苯酚1．O

mL。摇匀，迅速加入浓硫酸5．0mL，摇匀放置5min，分别于室温，40℃，60℃，

80℃和100℃下显色20min，测吸光度。

2、显色时间

吸取一定量样品，分别进行不同时间(10min，20min，30min，40min，

50min，60min)的显色反应后，测其吸光度。

3、显色剂用量

在其它条件不变(取以上得到的最佳显色条件)的情况下，只改变苯酚浓度

(3％，4％，5％，6％，7％，8％)，各测其吸光度，得到吸光度—显色剂浓度

曲线。

五、测定方法

1、制作标准曲线

准确称取标准葡聚糖(或葡萄糖)20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分

别吸取0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，1.4ml，1.6ml及1.8ml，各以水

补至2.0ml，然后加入5％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，静止10分钟，摇匀，室

温放置20分钟后于最大吸收波长（490nm左右）处测光密度，以2.0ml水按同

样显色操作为空白，以横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2、样品含量测定

吸取样品液1.0ml(相当于40ug左右的多糖)，加入5％苯酚1.0ml及浓硫酸

5.0ml，静止10分钟，摇匀，室温放置20分钟后于最大吸收波长（490nm左右）

处测光密度，以标准曲线计算多糖含量。

任务二浸提工艺条件花粉多糖提取工艺条件的优化

一、花粉多糖提取工艺流程

（一）工艺流程

荷花花粉→破壁→粉碎→过筛（40目）→脱脂→浸提→过滤→浓缩→醇沉→静

置→抽滤（除去乙醇，取沉淀）→除蛋白→醇沉→过滤→丙酮（或乙醚）洗涤→

干燥→粗多糖

（二）操作步骤

1、破壁：酶法破壁

2、脱脂：用石油醚回流2h，过滤。滤渣自然晾干，用95%乙醇回流2次，每次

2h，过滤，滤渣自然晾干。（云南产红花蜂花粉多糖的分离提取及含量测定）

3、浸提：加一定量的水在一定温度下浸提一定的时间

4、过滤：抽滤或离心，保留上清液

5、浓缩：旋转蒸发浓缩或真空浓缩，至原体积的1/4

6、醇沉：加4倍95%乙醇（或无水乙醇）沉淀多糖

7、静置：在4℃下静置24h

8、抽滤：除去乙醇，取沉淀

9、除蛋白：沉淀用Sevag法去除蛋白。向一定体积的多糖液中加入20％该体积

的氯仿，5％该体积的正丁醇，振荡20min后，离心，取上清液。至280nm无明