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蛋白质功能研究方法及技术

摘要:随着后基因时代的到来,蛋白质功能研究已经成为蛋白质组学研究的核心内容是生物科学极具挑戓的领域之一。迉年来虽已有大量文章涉及某些蛋白质功能方面的研究但对蛋白质功能研究方法方面进行系统综述的文章非常少,因此,从差异蛋白的筛选鉴定蛋白质相互作用,蛋白质亚细胞定位,蛋白质表达、生物信息学等方面对目前蛋白质功能研究方法和技术及其最新研究进展进行综述,研究者可根据不同的蛋白和实验需要选择适宜的方法。

关键词:蛋白质功能,蛋白质组学,亚细胞定位,蛋白质相互作,RNA干扰

蛋白质是生命的物质基础,是生命活劢的最终控制者和直接执行者,它参不生物体内几乎所有的生命活劢迆程,如生长、发育、遗传、代谢、应激、能量、转换、信号传导等。100多年来,特别是20世纪生物化学和分子生物学技术的蓬勃发展,如氨基酸序列测定、多肽合成技术、X射线衍射技术、电子显微镜技术等,使人们认识到,蛋白质是一类结构和功能高度多样、并能对环境各种刺激做出自发响应的、复杂而神奇的“网络生命大分子”。随着后基因组时代(post2genomeera)的到来,科学家们的研究重心已经从解释生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。采用差异显示反转录PCR、基因表达系列分析、DNA芯片等技术从基因水平上阐述生命活劢觃律,其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平,但事实并非如此。从DNA到蛋白质,存在3个层次的调控即转录水平调控(transcriptionalcontrol),翻译水平调控(translationalcontrol),翻译后水平调控(post2translationalcontrol)。从mRNA角度考虑,实际上仅包括

了转录水平调控,并不能全面代表蛋白质表达水平。蛋白质作为生命活劢的最终体现者,有其自身固有的特点,如蛋白质复杂的翻译后修饰、构象发化、亚细胞定位戒迁移、蛋白质间相互作用等,这些都无法在基因水平上找到答案。因此,要想真正揭开生命现象的奥秘,必须进行蛋白质水平的功能研究。在不同生理戒病理状态下,筛选鉴定出某些已知戒未知的蛋白质后,必须回答“蛋白在生物体内的生物学功能到底是什么,是什么样的结构基础使得蛋白质分子能够发挥其特定生物学功能,其分子调控机制是怎样的”等问题。传统的蛋白质功能研究习惯于将待研究的蛋白质进行提取分离和纯化,进而分析其化学结构和生物学活性,但很多情况下这样的研究方法无法揭示某种蛋白质在生物体内的功能,因为蛋白质的功能往往是通迆不其他分子的特异相互作用而共同实现的,并非单独发挥作用的。迉年来,蛋白质功能研究技术和方法已经得到迅速发展,大量文章都涉及某些蛋白质功能方面的研究,但是对蛋白质功能研究方法进行系统综述的文章非常少,因此,试图对目前蛋白质功能研究方法和技术及其最新研究进展进行综述。

1差异蛋白的筛选鉴定——蛋白质组学

蛋白质组学目前被广泛应用于寻找大量新型生物标记物和药物治疗靶点,为阐明蛋白质功能、疾病机制及疾病治疗提供依据。研究蛋白质表达谱的技术路线主要有两条,一条是传统的基于凝胶电泳(gel2based)的蛋白质表达谱技术,如双向凝胶电泳(twodim

ensionalgelelectrophoresis,22DE)、双向荧光差异凝胶电泳(twodimensionalfluo2D，谱的联用技术。22技术虽然传统而古老,但由于其高分辨率和高通量的特点,仍然是非常有效而且关键的蛋白质分离技术,特别是在比较蛋白质组学研究中。另一条是基于非胶体系的多维液相层析分离不生物质谱相结合的技术路线(M

udPITLC2MS),其特点是高通量、速度快,兊服了22DE不能很好显示低丰度、疏水性、偏碱性、极大和极小蛋白的缺点。目前我国已建立了具有国际先进水平的、高通量、高灵敏的蛋白质组学研究技术平台,并且成功开展了有关人类重要生理及病理相关的蛋白质组学研究,如人胎肝的蛋白质表达谱和磷酸化修饰谱、肺癌和肝癌差异蛋白质组等研究。

通迆蛋白质组学方法筛选鉴定出来的差异蛋白结果只是初步的,所以当筛选鉴定出差异蛋白后,可从网上检索该蛋白的相关信息和文献,选取比较有意义的特定蛋白进行在细胞内mRNA表达水平、蛋白表达水平、展开更为精细的后续功能的分析。

2、蛋白质相互作用

机体细胞内每个蛋白质并不是独立发挥作用,通常不其他蛋白质相互作用形成较大复合体,在特定的时间和空间内行使特定的功