包涵体蛋白质复性-纯化.pptVIP

1.对表达蛋白的胞内修饰过程不了解。

2.要求复杂和精确的复性过程

3.复性过程的收率往往很低，经常成为放大的

瓶颈

;分离纯化细菌包涵体蛋白质的基本步骤：

破碎细胞

(Disruptionofcell)

↓

分离包涵体

(Seperationofinclusionbody)

↓

溶解包涵体

(Dissolveinclusionbody)

↓

蛋白质产物的构象复原等。

(Recoveryoftargetproteinconformation)

;包涵体的复性前准备;包涵体的溶解;2.去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用（研究）。;4.还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mMDTT，也有使用5mM浓度。实际，还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。;(伸展态)U→(中间态)I→(自然态)N

↓

A（包涵体）

从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。;复性目的;复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态（？）恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M时复性过程已经结束。;蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。;三、包含体蛋白复性方法;复性常用方法;2.透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不适合大规模操作，无法应用到生产规模。

3.超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白聚集于膜上）。;4.色谱复性：辅助手段，兼具分离。

4.1凝胶过滤复性：除了蛋白质在胶粒中传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，对有些蛋白质的复性有利。;4.2吸附型层析复性：离子交换、疏水层析、亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。;;5.分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。

体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣的基因进行共表达；体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮助折叠。;复性过程中的添加剂;In-VitroRefoldingPathway;StandardIBRenaturationProcess;E.g1:rhGM-CSFfrE.coliinclusionbodies;;过程;包涵体-细胞破碎,冲洗和分离;溶解和准备样品;准备HiTrap?Chelating柱;纯化和复性;组份分析;;;信息;END