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利用PULL-DOWM实验发现靶标

药学121

王悦坤期刊介绍

杂志名称：ACSchemicalbiology

文献名称：IdentificationandValidationofCryptochromeInhibitors

ThatModulatetheMolecularCircadianClock

作者：SungKookChun,†,○JaebongJang,‡,○SooyoungChung,†

HwayoungYun,‡Nam-JungKim,§Jong-WhaJung,∥GiHoonSon,⊥

Young-GerSuh,*,‡andKyungjinKim*,†

发表时间：January3,2014

SCI分区：2区

IF：5.356

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相关介绍

该文献旨在确定新的小分子调制器影响生物钟的分子反馈回路。采用了两步筛选方法去发现药物的类似物，最终确定了候选物化合物15。通过化合物15利用pull-down实验发现靶标cryptochrome(CRY)1and2(CRY1/2)（隐花色素）。后表明化合物15能够抑制CRY1/2对分子生物钟的节律的影响。

化合物15

相关介绍

本实验中靶标是：cryptochrome（cry1和2）(隐花色素)

隐花色素是一种对磁场感知极为关键的蛋白质，在果蝇身上做

实验确定隐花色素确实可以使果蝇产生方向感，人类眼中同样

拥有隐花色素蛋白质，它能否在人类视网膜得到表达？就像一

种光敏磁受器？现在还尚未确定。

在该实验中的隐花色素的生物学性质是可以介导抑制时钟

调节：BMAL1异二聚体转录活性

相关原理

PULL-DOWN

PULL-DOWN实验可用来检测已知蛋白的表达和相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。PULL-DOWN实验至少需要一种纯化的标签蛋白（诱饵）用来捕获和“PULL-DOWN”靶蛋白（猎物）。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

在本实验中，为确定候选物15分子的靶点。制作与化合物15活

性相同的生物素偶联探针，利用生物素偶联探针在HEK293T细胞

裂解物中作为时钟蛋白表达诱饵。用20μM生物素标记化合物15对

HEK293T进行转染和孵育30分钟后，看是否存在自由竞争对手，

之后培养细胞裂解液48h，最后将结合物的培养与有抗生物素蛋白

涂层的磁珠在4°C下放2h。结合的蛋白质用标记的特异性抗

体通过免疫印迹法检测。最后发现可以和生物素共轭的化学探针

15特异结合的CRY1和CRY2。

相关原理

化合物15

生物素偶联探针

（具有化合物15

的生物活性）

诱导蛋白

HEK293T

细胞

转染

孵育30min

细胞裂解液

48h

结合培养物与有抗生物素蛋白涂层的磁珠在4°C.下孵育2h

发现化学探针15

特异结合的CRY1

和CRY2

结合的蛋白质用标记的特异性抗体通过免疫印迹法检测

实验结果与总结

生物素标记的化合物15作

为诱饵的化学结构

Pull-down分析CRY1/2-expressing

HEK293T细胞裂解物

小结：该实验利用了pull-down技术找到了化合物15的靶标

CRY1和CRY2

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