转座子在基因工程中的应用第十章.ppt

转座子在基因工程中的应用第十章;1.美国遗传学家B．McClintock的转座学说

2.转座子类型

3.转座机制

4.转座子在基因工程中的应用

;1.美国遗传学家B．McClintock的转座学说;转座子是染色体DNA上可复制和移动的DNA序列。一段DNA顺序可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称转座。这段序列称跳跃基因或转座子，可分插入序列（insertionsequence，IS）、转座子（transposon，Tn）、Mu噬菌体（Muphage）。按转座方式分复制性和非复制性转座子。;除IS1以外，所有已知IS序列都只有一个开放阅读框（openreadingframe，ORF），翻译起始位点紧接第一个反向重复区，终止点位于第二个反向重复区或重复区附近。IS1含有两个分开的读码框，只有移码通读才能产生功能型转座酶。一般情况下，每个IS转座频率是10－4～10－3／世代，恢复频率则低得多，为10－7～10－6／世代。;(2)转座子Tn;无论是IS或Tn的两端都有反向重复序列，两端反向重复序列的存在与它们的转座功能密切相关。如Tn3的两个IR中任一个顺式作用元件缺失都会阻止转座。;（3）转座噬菌体;Mu是DNA噬菌体，含有38kb线状DNA，两端各带一小段大肠杆菌的DNA，这与该噬菌体插入大肠杆菌染色体上有关。;2.2真核生物中的转座因子;Ty1因子只编码一条长5.7kb的mRNA，转录的启动子位于Ty1因子左端的LTR之中。mRNA编码两种蛋白质。在某些酵母品系中，Ty1因子可多达35个拷贝，但拷贝数因品系不同而有差别。

Ty1因子转座是通过一种RNA中间产物进行的，其过程类似反转录病毒的复制与整合，所以Ty1因子也称作反转录转座子。一般认为Ty1因子转座时，首先以其DNA为模板合成一个拷贝的RNA，然后再通过反转录合成一条新的Ty1因子，最后这条新的Ty1转座子再插入到新的位点上;酿酒酵母中有控制a与α两种接合型的两个基因a与α。这两个基因都能转座。

当a基因从它的位置HMR转座到MAT位置后便能表达，细胞就成为a接合型；

当α基因从它的位置HML转座到MAT后，原来在MAT上的a基因消失，α基因得以表达，细胞便能转换成α接合型。这两个转座子具有明显的生理功能，它们与其他转座子不同之处是???能转座到MAT这一个位置上，而其他的转座子几乎可以转座到该基因组中任何位置上。

酵母接合型相互转换是属于复制型转座。;3.转座机制;连接：供体和受体结合成为共联体，其过程是使供体切下IS或Tn3反向重复序列末端和受体黏性末端以共价链齐头相连，形成两个“缺口”。

复制：由DNA多聚酶进行修补复制补上缺口，由连接酶连接。于是在IS两端形成了两个正向重复序列（DR），一般为5～9bp，最长的12bp。

重组：在特定位点（黑色部分）进行重组，结果共联体分离形成两部分，一个是原来含有转座子的序列，另一个是通过转座插入了转座子的序列。;（2）非复制型转座;4.转座子在基因工程中的应用;;该技术的原理：由于转座子序列可以在基因组中转座，如该序列转座正好插入某一基因的外显子区域时，导致该基因失活，使其表型改变而成为突变体，如该突变是由于转座子的DNA克隆，其中必定含有与该突变体有关的基因。也就是说，用转座子给未知的目的基因加以标记，便于对该基因的识别与分离。

用该突变型提取DNA构建基因组DNA文库，用标记的转座子序列作为探针，筛选出的克隆中，再对转座子两端序列进行亚克隆，这便是被转座子插入的基因序列。;对于微生物，也能利用转座子突变制备随机突变库，从中筛选具有目的性状的菌株，通过反向PCR或杂交技术确定插入失活的基因。从而确定表型与基因型关系。

也可循环操作不断改良细胞;（4)随机删减基因组;（5)基因修复和基因治疗