《中级食品检验工 》课件——实训任务7 大肠菌群的测定.ppt

实训任务7大肠菌群的测定中级食品检验工

目录二仪器和用具一测定原理三培养基及试剂四操作方法五注意事项

大肠菌群是指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。食品中的大肠菌群数是以每100mL（g）检样内大肠菌群的最可能数（简称MPN）表示。据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均应以100mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。检查大肠菌群数，一方面能表明食品中有无粪便污染，另一方面还可以根据大肠菌群数量的多少，判定食品受污染的程度。一、测定原理

二、仪器和用具恒温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计。平皿：直径为90mm。试管、广口瓶或三角瓶、吸量管、载玻片、接种针。玻璃珠：直径约为5mm。酒精灯、试管架。

单料乳糖胆盐发酵管。双料乳糖胆盐发酵管。乳糖发酵管。伊红美蓝琼脂（EMB）。生理盐水。革兰氏染色液。三、培养基及试剂

1、检样稀释（1）以无菌操作将检样25mL（25g）放于含有225mL灭菌生理盐水的灭菌三角烧瓶内或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1:10的均匀稀释液。（2）用1mL灭菌吸量管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管使其混匀，制成1:100的稀释液。（3）另取1mL灭菌吸量管，按上项操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸量管。（4）根据焙烤食品及糖果卫生标准的要求或对检样污染情况的估计，选择3个稀释度，每个稀释度进行3次接种。四、操作方法

2、发酵实验选择3个稀释度的样品分别接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，可用双料乳糖胆盐发酵管；接种量为1mL及1mL以下者，可用单料乳糖胆盐发酵管。每个稀释度的样品接种3管，置于36±1℃的恒温箱内，培养24±2h，若所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告大肠菌群阴性：若有产气者，则按下列程序进行检验。四、操作方法

（1）分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置于36±1℃的恒温箱内，培养18-24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色、镜检和乳糖复发酵实验。四、操作方法

（2）复发酵证实实验在上述平板上、挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于36±1℃的恒温箱内培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。四、操作方法3、报告根据实验确定大肠菌群为阳性的管数，报告每100mL（g）大肠菌群的最可能数。

1）程序大肠菌群的国标检验法采用三步法，即乳糖发酵、分离培养和证实实验。第一步乳糖发酵实验是检验样品的发酵结果，不是纯菌的发酵实验，所以初发酵阳性管经过后两步操作有可能成为阴性。大量检验数据证明，食品中大肠菌群检验程序的符合率、初发酵与证实实验相差很大。一般来说，如果平板上有较多典型的大肠菌群菌落，革兰氏染色为阴性杆菌，即可做出判定。如果平板上典型菌落较少或均不够典型，则应多挑菌落做证实实验，以免出现假阴性。只做一步初发酵，对某些食品来说误差较大。这样做，会有相当部分的合格样品被作为不合格样品处理，应予以注意。五、注意事项

2）挑取菌落大肠菌群是一群肠道杆菌的总称，大肠菌群菌落的色泽、形态等复杂多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。在实际工作中，为了提高大肠菌群的检出率，应当熟悉其菌落的形态和色泽。在检验方法中我们选用伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落大多呈紫黑色，有金属光泽或无金属光泽。菌落形态的其他方面（如菌落的大小、光滑与粗糙程度、边缘完整情况、隆起情况、湿润与干燥情况等）虽也应注意，但不如色泽方面更为重要。五、注意事项

选取的菌落数与大肠菌群的检出率也有密切的关系。在实际工作中，由于工作量较大，操作人员通常只挑取一个菌落检验，但影响大肠菌群检出率的因素很多，如食品种类、菌落色泽和形态、细菌种类等，只挑取一个菌落，由于概率问题，很难避免假阴性的出现，尤其当菌落不典型时，更是如此。所以，挑取菌落时一定要挑取典型菌落，若无典型菌落则应多挑取几个菌落，以免出现假阴性。五、注意事项2）挑取菌落

3）产气量在糖发酵实验中经常可以看到，在发酵套管内存在极微小的气泡（有时比小米粒还小），类似这种情况能否算作产气阳性，这是许多人经常遇到的问题。大肠菌群的产气量多时可以使发酵套管充满气体，少时产生比小米粒还小的气泡。一般来说，产气量与大肠菌群检出率呈正相关，但随样品种类而有不同，有米粒大小气泡的也有阳性检出。五、注意事项

另外，对未产气的乳糖发酵管是否均应做阴性处理，根据大量实践工作经验