SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点.docxVIP

SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点

随着对非典型肺炎的病原学、流行病学、诊断和治疗等学科进行全面深入的研究，在各领域已取得重要进展，尤其是确定了SARS病毒为其病原体，已成功分离到多株SARS病毒，并已验证其能在Vero细胞和2BS等细胞系中培养增殖，这为研制疫苗提供了基础和基本条件。但是由于SARS病毒的研究有待进一步深入，疫苗的研制尚存在很多的不确定因素。为使SARS病毒灭活疫苗的临床前研究工作科学规范，特制定SARS病毒灭活疫苗临床前研究考虑要点。

一、毒种

研究本疫苗所用的毒种须证明为SARS病毒，如该毒种分离自人体，须提供以下资料

（一）病毒株名称及来源

1．名称

2．宿主情况：

（1）病人姓名、年龄、性别、民族、家庭住址；

（2）发病地点、发病日期；

（3）收住入院日期、临床确诊日期、实验室确诊日期；

（4）病人病程及病人转归：死亡、痊愈、是否有后遗症；

（5）毒株分离原样本：

咽试子、漱口液、痰液、血液、粪便或尸解标本组织名称；

（6）取样日期；

（7）取样时病人的病期；

（8）取样地点；

（9）病人是否留有恢复期血清；

如有：采血日期（病期）和血清量；

鉴于人类咽试子、漱口液、痰液、粪便等样品难免污染其他外原因子，因此建议尽可能采用病人血液分离的病毒株。

（二）毒株分离过程

1．用细胞分离病毒，须提供所用细胞名称、代次、来源和细胞无菌检测、外原因子检测等资料；鉴于VeroE6细胞的生物学特性，用VeroE6细胞分离的SARS病毒不能直接用于疫苗生产用毒种，须将VeroE6细胞的适应株重新转适应到Vero细胞或二倍体细胞株的毒种方能用于生产，因此建议尽可能使用直接以Vero细胞或二倍体细胞株分离的毒种。

2．通过动物分离病毒，须提供所用动物名称、动物品系、动物级别、动物年龄和制备毒种的动物脏器名称等资料；如再适应到细胞，则还须提供1．项所述的细胞资料。

（三）病毒分离传代特性

样品处理方法、首次盲传确证病毒阳性代次、病毒确证检定方法、每代培养天数、病毒滴度、滴定方法、动物是否发病或死亡等资料。

（四）毒种建立和保存

原始毒种代次、毒种病毒滴度、毒种添加的保护剂的名称和浓度、毒种存储条件。

毒种批的建立应按《中国生物制品规程》疫苗毒种要求进行，应建立原始毒种、主毒种和工作毒种批三级毒种库，主种子和工作种子批还须有毒种的限定代次的资料，以证明主种子和工作种子批在规定代次内的生物学特性与原始毒种一致。

（五）毒种的检定

1．毒种的鉴别试验：

应提供检定方法、检定日期、检定结果等资料，建议采用下述方法进行鉴别试验：

（1）可使用确诊为SARS病人的恢复期高效价血清中和病毒。

（2）测定中和前后的病毒滴度。

（3）应有病毒株的核酸全序列分析的资料，包括序列测定的方案、测定方法和测定结果，测定结果应附核酸序列图、推导的氨基酸序列图、种系发生树图等以进一步证明为SARS冠状病毒。

2．毒种的无菌试验

应根据《中国生物制品规程》疫苗生产用毒种的要求进行无菌试验检查。

3．毒种的外源因子检查

应用证明为SARS病毒感染的单人份病人血清中和本病毒。完全中和病毒后（如不能一次中和，可用另一病人血清再一次中和后）按下列方法进行动物和细胞检查。

（1）动物试验法

小鼠

取15-20g小鼠至少10只，用经中和后的病毒悬液，每只脑内接种0．03ml，腹腔接种0．5ml。至少观察21天。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，为了检查病毒感染的证据，直接肉眼观察其病理改变，并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只小鼠并观察21天。如果没有小鼠表现出病毒感染现象，则病毒种子符合要求。在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活试验才有效。

乳鼠

出生后24小时以内的乳鼠，至少10只，用经中和后的病毒悬液，脑内接种0．01ml，腹腔接种至少0．1ml。每天观察，至少14天。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接肉眼观察其病理改变，并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液脑内和腹腔接种另外至少5只小鼠并每天观察，观察14天。如果没有小鼠表现出有病毒感染现象，该病毒种子通过试验。在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活试验才有效。

（2）细胞培养法

·非血吸附病毒检查

中和后的病毒悬液，还应分别接种于人源、猴源和生产用的同种不同批的细胞。如果是利用人二倍体细胞生产的，还应接种另外一株人二倍体细胞。每种细胞最少接种6瓶，每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25%。于36±1℃培养，观察二周，或最后一次收获病毒液时间检查是否有CPE出现。未见C