4非肠道原核细菌基因工程(正)【52页】.pptxVIP

;第4章非肠道原核细菌基因工程;E芽孢杆菌的分泌表达系统;*革兰阳性细菌、好氧、杆状

*一旦营养供应受限即形成芽孢;芽孢杆菌表达外源基因的优、缺点;1、两类复制子：

①金黄色葡萄球菌型复制子，如pUB110、pC194和pE194；

②短小芽孢杆菌型复制子，如pHY481和pWT481。;2、异源启动子：

大肠杆菌系统的启动子结构与芽孢杆菌的高度相似，

异源启动子有效。;可诱导型操作子：

A.大肠杆菌的lac系统，包括lacI阻遏蛋白编码基因

B.λ或φ105噬菌体的操作子区及温度敏感型阻遏蛋白基因

C.枯草芽孢杆菌蔗糖可诱导基因sacB的调控序列;枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)

短小芽孢杆菌（Bacillusbrevis)

地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis);（1）枯草芽孢杆菌;（2）短小芽孢杆菌;（3）地衣芽孢杆菌;D芽孢杆菌的转化系统;1、短小芽孢杆菌胞壁蛋白操纵子调控元件

中壁蛋白（MWP）和外壁蛋白（OWP）基因组成一个操纵子（cwp），其5’端（0.6kb)基因表达调控序列（由启动子、SD序列、翻译起始位点和分泌信号肽编码序列组成）可用于外源基因的分泌表达。

调控机制：

完整的胞壁阻遏转录，生长稳定期胞壁蛋白的脱落和介质中低浓度的Mg++诱导（去阻遏）分泌表达;;短小芽孢杆菌胞壁蛋白操纵子;2、枯草芽孢杆菌胞外果聚糖酶操纵子调控元件;F重组芽孢杆菌在昆虫毒素蛋白生产中的应用;;某些苏云氏芽孢杆菌菌株能同时合成多种不同的杀虫蛋白组分，这些不同的组分对应不同的杀虫谱，基本上可以分为5大类，分别命名为cryI、cryII、cryIII、cryIV、cryV基因。;（1）将枯草芽孢杆菌的初级代谢启动子取代杀虫蛋白基因

的自身启动子（全程表达）。

（2）将多种杀虫蛋白基因嵌合在一起进行融合表达，以构

建对抗多种害虫的多价工程菌。

（3）通过基因定向突变技术改变杀虫蛋白的氨基酸序列，

以增强杀虫蛋白的毒性作用，扩展杀虫选择范围。

;链霉菌的基因工程;革兰阳性、好氧、丝状、原核细菌

生长周期：孢子发芽、营养菌丝和气生菌丝形成、孢子生成

具有完善的代谢和分泌系统，能够分解大多数稳定的生物多聚物以及一些人工合成的高分??化合物

丰富的次级代谢途径以及初级代谢与次级代谢之间的严密调控体系

60％以上抗生素由链霉菌合成;B链霉菌的载体克隆系统;变铅青链霉菌66株+天蓝色链霉菌A3(2)株=接合

后者染色体DNA的一段序列转入接合受体菌SLP1.2

（4-5个拷贝）;①pIJ702;②pIJ61;③pIJ922;④pIJ699;⑤pIJ486／487;⑥pKC796;KC噬菌体载体系列;C链霉菌的宿主转化系统;变铅青链霉菌;1、原生质体转化法;转化操作关键：加入DNA之前原生质体的洗涤、DNA与原生质体混合后，PEG缓冲液的迅速加入;2、原生质体转染法;3、完整菌丝体转化法;D链霉菌的基因表达调控系统;1、启动子;2、终止子;3、核糖体结合位点;4、密码子;5、基因表达的反式调控元件;E链霉菌的蛋白分泌系统;1、链霉菌蛋白质的信号肽序列;2、成熟蛋白质对分泌的影响

;3、培养基及发酵条件对异源重组蛋白高效分泌表达的影响;4、同源和异源蛋白在重组链霉菌中的高效分泌表达;F利用DNA重组技术改良抗生素生产菌;已

克

隆

鉴

定

的抗生素生物合成基因簇;（1）强化表达生物合成途径中的关键酶基因。

（2）定向突变关键酶的编码基因。

（3）随机重组相似的抗生素生物合成途径。