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;第4章非肠道原核细菌基因工程;E芽孢杆菌的分泌表达系统;*革兰阳性细菌、好氧、杆状
*一旦营养供应受限即形成芽孢;芽孢杆菌表达外源基因的优、缺点;1、两类复制子:
①金黄色葡萄球菌型复制子,如pUB110、pC194和pE194;
②短小芽孢杆菌型复制子,如pHY481和pWT481。;2、异源启动子:
大肠杆菌系统的启动子结构与芽孢杆菌的高度相似,
异源启动子有效。;可诱导型操作子:
A.大肠杆菌的lac系统,包括lacI阻遏蛋白编码基因
B.λ或φ105噬菌体的操作子区及温度敏感型阻遏蛋白基因
C.枯草芽孢杆菌蔗糖可诱导基因sacB的调控序列;枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)
短小芽孢杆菌(Bacillusbrevis)
地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis);(1)枯草芽孢杆菌;(2)短小芽孢杆菌;(3)地衣芽孢杆菌;D芽孢杆菌的转化系统;1、短小芽孢杆菌胞壁蛋白操纵子调控元件
中壁蛋白(MWP)和外壁蛋白(OWP)基因组成一个操纵子(cwp),其5’端(0.6kb)基因表达调控序列(由启动子、SD序列、翻译起始位点和分泌信号肽编码序列组成)可用于外源基因的分泌表达。
调控机制:
完整的胞壁阻遏转录,生长稳定期胞壁蛋白的脱落和介质中低浓度的Mg++诱导(去阻遏)分泌表达;;短小芽孢杆菌胞壁蛋白操纵子;2、枯草芽孢杆菌胞外果聚糖酶操纵子调控元件;F重组芽孢杆菌在昆虫毒素蛋白生产中的应用;;某些苏云氏芽孢杆菌菌株能同时合成多种不同的杀虫蛋白组分,这些不同的组分对应不同的杀虫谱,基本上可以分为5大类,分别命名为cryI、cryII、cryIII、cryIV、cryV基因。;(1)将枯草芽孢杆菌的初级代谢启动子取代杀虫蛋白基因
的自身启动子(全程表达)。
(2)将多种杀虫蛋白基因嵌合在一起进行融合表达,以构
建对抗多种害虫的多价工程菌。
(3)通过基因定向突变技术改变杀虫蛋白的氨基酸序列,
以增强杀虫蛋白的毒性作用,扩展杀虫选择范围。
;链霉菌的基因工程;革兰阳性、好氧、丝状、原核细菌
生长周期:孢子发芽、营养菌丝和气生菌丝形成、孢子生成
具有完善的代谢和分泌系统,能够分解大多数稳定的生物多聚物以及一些人工合成的高分??化合物
丰富的次级代谢途径以及初级代谢与次级代谢之间的严密调控体系
60%以上抗生素由链霉菌合成;B链霉菌的载体克隆系统;变铅青链霉菌66株+天蓝色链霉菌A3(2)株=接合
后者染色体DNA的一段序列转入接合受体菌SLP1.2
(4-5个拷贝);①pIJ702;②pIJ61;③pIJ922;④pIJ699;⑤pIJ486/487;⑥pKC796;KC噬菌体载体系列;C链霉菌的宿主转化系统;变铅青链霉菌;1、原生质体转化法;转化操作关键:加入DNA之前原生质体的洗涤、DNA与原生质体混合后,PEG缓冲液的迅速加入;2、原生质体转染法;3、完整菌丝体转化法;D链霉菌的基因表达调控系统;1、启动子;2、终止子;3、核糖体结合位点;4、密码子;5、基因表达的反式调控元件;E链霉菌的蛋白分泌系统;1、链霉菌蛋白质的信号肽序列;2、成熟蛋白质对分泌的影响
;3、培养基及发酵条件对异源重组蛋白高效分泌表达的影响;4、同源和异源蛋白在重组链霉菌中的高效分泌表达;F利用DNA重组技术改良抗生素生产菌;已
克
隆
鉴
定
的抗生素生物合成基因簇;(1)强化表达生物合成途径中的关键酶基因。
(2)定向突变关键酶的编码基因。
(3)随机重组相似的抗生素生物合成途径。
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