分子生物学常用技术.ppt

分子生物学

常用技术;核酸的分子杂交

Nucleicacidhybridization;;;核酸分子杂交的根本过程:

首先要确定检测的目标，即检测的目的核酸片段，这个片段的序列必须是的。

根据此设计一个探针〔与检测目的核酸互补的序列〕，并对其进行合成和标记。

再通过杂交实验来完成探针对目的核酸的检测。;分子杂交的形式：

液相杂交

固相杂交

它们之间的区别和优劣;固相杂交的一般过程

1.首先设计、合成探针。

2.收集标本，并提取核酸。

3.将提好的核酸样本点到固相支持物上。

4.封闭。

5.通过变性和复性完成杂交。

6.漂洗

7.放射自显影;核酸分子杂交技术的演变

斑点杂交

southernblot

northernblot

原位杂交

芯片技术;斑点杂交;southernblot;southernblot;原位杂交;组织切片上的原位杂交;芯片技术;;;Dec2002GoldenPath

;Medianintermarkerdistance:8.5kb

Meanintermarkerdistance:23.6kb

AverageHeterozygosity0.30

Averageminorallelefrequency0.22

;聚合酶链式反响;PCR技术的形成及开展;PCR示意图;PCR的改进与完善;1988年Saiki等从温泉中别离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反响2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反响2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反响2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反响后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现为PCR技术的广泛应用打下了根底。;PCR技术的实验原理;;;;;;;;;PCR反响的根本条件;引物的设计：

引物的设计首先要依据你的序列来设计。即你要扩增的目的DNA片段。这些资料可以从文献上查找或从互联网上来检索。

实际做的过程中，引物也可借助于别人已经发表的引物来。但从经验上说，别人公开发表的引物常常含有一定的错误。所以要进行核查。;设计??物应遵循以下原那么：

???①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

???②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

???③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，防止5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

???④防止引物内部出现二级结构，防止两条引物间互补，特别是3端的互补，否那么会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。;⑤引物-3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以防止因末端碱基不配对而导致PCR失败。

?⑥引物中有或能加上适宜的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

???⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的时机。;PCR所用试剂：

DNA聚合酶

buffer:包括两种，一种是含Mg++，一种是不含Mg++。

dNTPs

纯洁水

自己要准备的模板DNA的制备和引物的设计与合成。;PCR的操作过程;加样：

单样本加样

多样本加样

加样的顺序

PCR反响条件的设定：

预就性温度：94℃，5分

变性温度：94℃，30秒

退火温度：需要摸条件

延伸温度：72℃，30秒

总延