流式细胞术的原理.ppt

1.样本制备样本来源血液骨髓淋巴结体液（尿液、脑脊液、胸腹腔积液）灌洗液（肺泡支气管）加抗凝剂（EDTA），室温保存，24h内实体组织机械法制备单细胞悬液，保持抗原活性，不宜用酶、表面活性剂2.免疫荧光染色染色方式的选择直接染色—标有荧光染料的抗体直接特异结合目标抗原。—首选的方式：方便快捷、经济、准确、非特异结合少间接染色—标有荧光染料的二抗间接特异结合目标抗原。—在直接染色不能实现的情况下，选用的方式：非特异性结合相对增加。在流式试剂日益全面的情况下，越来越少的客户选择这种方式。仅适用于研究最新发现抗原的客户。荧光染料的选择1，首先，了解目标抗原1）细胞表面抗原2）细胞内或是核内抗原（固定、透膜步骤）3）以上两者兼备。先标记表面抗原，固定后，破膜标记胞内抗原。4）细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑制剂，如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌到细胞外。（活化、固定、透膜）2，了解荧光染料及其工作原理，做出准确的选择。荧光染料的种类荧光染料分为三大类1.小分子化合物：FITC、PacificBlue2.大分子荧光蛋白：AmCyan，PerCP，PE,APC3.串联染料：PerCP-Cy5.5，PE-Cy5如何正确选择与使用荧光素仪器配置：有哪些激光器与接收通道多色实验中，尽量减少荧光素之间的相互干扰—如APC与Cy5不能串联使用，两者光谱重叠大，补偿不好调。BD网站提供每一种荧光素的激发以及发射光谱如何正确选择与使用荧光素仪器配置：有哪些激光器与接收通道多色实验中，尽量减少荧光素之间的相互干扰—如APC与Cy5不能串联使用，两者光谱重叠大，补偿不好调。尽量选择应用广、亮度高的荧光素—荧光素的强弱用StainIndex染色指数来表示，数值越大，信噪比越高。多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目标抗原—例如，PE，APC这类大分子蛋白相对亮度高。SI值如何正确选择与使用荧光素仪器配置：有哪些激光器与接收通道多色实验中，尽量减少荧光素之间的相互干扰—如APC与Cy5不能串联使用，两者光谱重叠大，补偿不好调。尽量选择应用广、亮度高的荧光素—荧光素的强弱用StainIndex染色指数来表示，数值越大，信噪比越高。多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目标抗原—例如，PE，APC这类大分子蛋白相对亮度高。关注F/P比值—尤其是使用小分子荧光素，一个抗体上会标记多个荧光素分子。在细胞本身自发荧光强的情况下，使用发射光波长大于600nm的荧光染料。避免使用串联染料，不稳定，可能发生降解。常用的荧光素组合Thanks!**最后一个只有具有分选功能的仪器才会拥有。*石英玻璃（Calibur）中央开了长方形孔430umx180um允许单细胞逐个通过检验区1).液流驱动系统包括压缩空气泵、压力传感器、鞘液过滤器和样本压力调节器。压缩空气泵给予细胞流鞘液流恒定的气体压力。（referenceP7）在这恒定的气体压力下，处理好的待测样本进入流动室。同时已过滤的（不含细胞或微粒的）鞘液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样本流形成一定角度，根据流体力学的层流原理使鞘液包绕着样本流高速流动。鞘液的作用有三种：1.防止样本靠近喷孔壁，避免堵塞喷孔；2.约束样本位于喷嘴中心，提高测量精度；3.鞘液成分基本相似于活细胞生存环境，有利于保持细胞状态。Note：鞘液很重要，首先鞘液不好影响细胞状态，尤其是分选细胞。其次，鞘液如果存在气泡、杂质就会影响细胞测量数据的精确性。*（压缩空气泵、压力传感器、鞘液过滤器）这3样都讲完了，样本压力调节器/阀可以调节样本进样速率，可以提高采样分析速度。高压力（high）时，样本流变宽，细胞间距缩短，细胞受激光照射能量不一样，这会造成一定的误差。因此高分辨率的样本测定例如DNA分析时应选择低压（Low）。**BD的激光器多达10几种可供客户选择定制型的FCM已经可以配置7根激光器*光束成形和收集系统具体是多组透镜（lens）、光学滤片和小孔。*经过一系列光学滤片及双色性反射镜的干扰信号去除，SSC与荧光信号都是由光电倍增管PMT收集的。*当激光垂直照射在样本细胞或微粒上，将激发不同的光信号：1.forwardscatter,FSC向前散射光，与激光光束几乎平行（偏离度1°-6°），主要反映被测微粒的体积大小。2.sidescatter,SSC侧向散射光，与激光光束和液流形成平面呈垂直，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。3.