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分子标记技术简介

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记,是DNA水平

遗传多态性的直接的反映。与其它几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细

胞学标记相比,DNA分子标记具有的优越性有:大多数分子标记为共显性,对隐性的

性状的选择十分便利;基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的;在生

物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析;分子标记揭示来自DNA的变

异;表现为中性,不影响目标性状的表示,与不良性状无连锁;检测手段简单、迅

速。随着分子生物学技术的发展,现在DNA分子标记技术已有数十种,广泛应用于遗

传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆

等方面。

分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的

DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的

特异性DNA片段。

理想的分子标记必须达以下几个要求:(1)具有高的多态性;(2)共显性遗传,

即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型;(3)能明确辨别等位基因;(4)

遍布整个基因组;(5)除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;

(6)选择中性(即无基因多效性);(7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化);

(8)开发成本和使用成本尽量低廉;(9)在实验室内和实验室间重复性好(便于数据

交换)。可是,当前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。

【分子标记的种类】

一、基于分子杂交技术的分子标记技术

此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA分子,然

后用经标记的特异DNA探针与之进行杂交,经过放射自显影或非同位素显色技术来

揭示DNA的多态性。

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①限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,

RFLP)

1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术,它是一种以

DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理:利用特定的限制性内切酶

识别并切割不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA片段,所产生的DNA数

目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。经过凝胶电泳分析

这些片段,就形成不同带,然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影,即

获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后

产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等

变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。

RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制,一般可检测到

的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷,主要是克隆可表现基因组DNA

多态性的探针较为困难;另外,实验操作较繁锁,检测周期长,成本费用也很高。自

RFLP问世以来,已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等

研究中仍得到了广泛的应用。

②数目可变串联重复多态性(VariableNumberofTandemRepeats,VNTR)

数目可变串联重复序列又称小卫星DNA(MinisatelliteDNA),是一种重复DNA

小序列,为10到几百核苷酸,拷贝数10一10001不等。VNTR基本原理与RFLP大致

相同,只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求:(1)限制性内切酶的酶切位点必

须不在重复序列中,以保证小卫星或微卫星序列的完整性。(2)内切酶在基因组的其

它部位有较多酶切位点,则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列,经过电泳可

充分显示不同长度重复序列片段的多态性。(3)分子杂交所用DNA探针核昔酸序列必

须是小卫星序列或微卫星序列,经过分子杂交和放射自显影后,就可一次性检测到

众多小卫星或微卫星位点,得