生物化学实验(2).pptxVIP

生物化学实验;目录;实验一糖类的定量测定

—3，5-二硝基水杨酸比色定糖法

一、实验目的

1．掌握3，5一二硝基水杨酸法定糖的原理及方法。

2．用3，5一二硝基水杨酸比色法测定山芋粉中总糖。

3．熟悉分光光度计的原理及使用方法。;

二、实验原理;三、实验操作

（一）样品中总糖的水解及提取准确称取山芋粉1g，放入小三角烧瓶中，加入10ml6NHCL和15ml蒸馏水，混匀。在沸水浴加热30min后，用KI-I2溶液检查水解程度。若已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入酚酞试剂一滴，以10%NaOH中和至溶液呈微红色。过滤并定容至100ml。再精确吸取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶，稀释到刻度，备用。;;表1-1制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量;将以上各管溶液混匀后，用分光光度计(520nm)进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制出标准曲线。一大组同学做一个标准曲线

（三）样品中含糖量的测定

取4支大试管，分别按表1—2加入各种试剂。;;;四、实验要求

1.实验过程中所有的试管要干净，加入各种试剂量要准确。

2.试剂不可倒出试剂瓶，用干净的移液管吸取，用后盖好瓶塞，防回原处。

3.分光光度计使用：溶液不要倒太多；毛边不要对着透光处；用后用自来水冲洗干净，防回原处。

4.移液管使用：有色看外边缘，无色看中间凹处。

5.实验室中所有的仪器上面不能放置烧杯、试管、试剂瓶等，以防试剂污染仪器。

6.每组同学离开实验室时，须经实验老师检查并同意后，方可离开。

7.值日生打扫干净实验室后，方可离开。

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;二、实验原理;

纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多，随有机??移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf值。

Rf值的定义：

Rf=(原点到层析斑点中心的距离)/（原点到溶剂前沿的距离）;影响Rf值的因素有：

①物质本身的化学结构；

②展层所用溶剂系统；

③展层剂pH值；

④展层时的温度；

⑤展层所用滤纸；

⑥展层的方向(横向，上行或下行)。

用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献Rf值进行鉴定。;三、实验操作

1．纸的处理

取18cm长、18cm宽的滤纸一张，离底边2cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点(原点)划圈，使圈的直径小于0.5cm。

2．点样

在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样可写M），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点1次。每个样品共点2次。

;3．层析

将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触(见图1)。

将培养皿中放入2／3量的展层剂，放入层析缸中，然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点，开始层析。

当溶剂前沿到达离上端2cm处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿，晾干。;图1.滤纸的缝合;4．显色

用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚三酮，晾干后，将滤纸放入烘箱中(80-100℃)，烘烤5分钟后，滤纸上即显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓(见图2)

四.结果处理

用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。;图2.层析谱

1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿;五、实验建议

(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。

(2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。

(3)展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。

(4)点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否