质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选鉴定.pdfVIP

质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选鉴定

陈倩倩交流生118627140313

一、实验目的：

1、学习和掌握限制性内切酶的特性

2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法

3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法

4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法

5、掌握α互补筛选法的原理

6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法

7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法

二、实验原理:

重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核

酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。

限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA分子小

的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较

简单。

DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克

隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA连接酶：T4DNA连接酶。T4DNA连接酶

在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA

分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。

目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以TDNA连接酶为例）主要有以下几种：

4

（一）、具互补粘性末端片段之间的连接

（二）、平末端的连接

所谓受体细胞（receptorcell）又称为宿主细胞或寄主细胞（hostcell）等，从实验技术

上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价

值的细胞。显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞。一般情况下，受体细胞的选择应符

合以下基本原则：

（1）便于重组DNA分子的导入；（2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；（3）便于重组

体的筛选；（4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长；（5）安全性高，无致病性，不会

对外界环境造成生物污染；（6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于

外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达；（7）受体细胞在遗

传密码的应用上无明显偏倚性；（8）具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效

表达；（9）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。以上是受体细胞选择的总原则，在

实际应用过程中，可根据具体需要或用途而重点考虑其中部分要求即可。

原核生物细胞:是较为理想的受体细胞类型，其原因是：

（1）大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA进入；（2）没有核

膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦；

（3）基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；（4）

原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验

周期短，重复实验快。

鉴于上述原因，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和cDNA文库，或者用

来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主菌。至今被用作受体菌的原核

生物有大肠杆菌、枯草杆菌等。大肠杆菌是迄今为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核

生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。

以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤：

（1）细菌感受态的形成；（2）转化因子的吸收；（3）整合复合物前体的形成；（4）单链DNA

转化因子的整合；（5）转化子的形成。

2

Ca诱导的转化：细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受

态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌

细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。其原理是将处于对数生长期的细菌

置于0℃，CaCL低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，同时Ca2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，

2

使得位于外膜