分子生物学技术-课件.ppt

分子生物学常用实验技术

ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology

;现代分子生物学;遗传中心法那么;

基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系

;整合也是创新;21世纪分子医学开展的主要领域;第一讲

蛋白质的别离、纯化、鉴定和结构分析

Isolation,Purification,Identification

andStructuralAnalysisofProteins;一、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀:

是常用的蛋白质沉淀方法;;将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。

利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中别离获得抗原蛋白。;二、透析及超滤法:

可去除蛋白质溶液中的小分子化合物;三、电泳:

是蛋白质别离与鉴定的常用方法;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。

等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而别离蛋白质的电泳方法。

双向凝胶电泳，蛋白质组学研究的重要技术。;;二维电泳图;四、应用相分配或亲和原理：

可将蛋白质进行层析别离;离子交换层析：

利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行别离。

凝胶过滤(gelfiltration)：

又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同别离。;五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同：

可进行超速离心别离;因为沉降系数S大体上与分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。;六、用化学或反向遗传学方法：

可分析或演绎多肽链的氨基酸序列;化学法;通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：;七、应用物理学、生物信息学原理：可进行蛋白质空间结构测定或预测;X射线衍射法(X-raydiffraction)

核磁共振技术(nuclearmagneticresonance,NMR)

是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。;1A;*用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的根本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。;*;*;*;核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)

在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。;复性;印迹技术;用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

是基因诊断的常用技术;基因诊断之父—简悦威;基因诊断的概念、特点及临床意义;诊断依据(遗传物质改变)

DNA、RNA或蛋白质水平变化。如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；

基因结构变化。如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。;基因诊断的特点

高特异性

高灵敏性

早期诊断性

应用广泛性;基因诊断中常用的分子生物学技术;基因诊断中常用的分子生物学方法比较;印迹技术;*;EdwinSouthern;核酸分子杂交流程;*;Northern印迹;RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的mRNA分子的含量与大小。;*;三种印迹技术的比较;*;*;斑点杂交〔dotblotting〕;反向斑点杂交

〔reversedotblotting〕;*;荧光原位杂交〔FISH〕;*;固相夹心杂交法

(sandwichhybridization);;基因诊断技术路线与方法;〔一〕直接诊断途径;5/—;斑点杂交、反向斑点杂交

AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、

PCR产物直接测序;在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丧失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体〔如唐氏综合征〕等。;;根据引物3′端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物

;3.基因表达异常的检测

mRNA的相对定量分析

mRNA的绝对定量分析

mRNA长度分析;〔二〕间接诊断途径;

DNA多态性：

指群体中的DNA分子存在至少两种不