T_CVMA 145-2024 牛呼吸道合胞体病毒实时荧光RT-PCR 检测方法.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准

T/CVMA145—2024

牛呼吸道合胞体病毒实时荧光RT-PCR检测方法

Real-timeRT-PCRmethodfordetectionofBovinerespiratorysyncytialvirus

2024-2-7发布2024-2-7实施

中国兽医协会发布

I

T/CVMA145—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南冠牧生物科技有限公司提出。

本文件由中国兽医协会归口。

本文件起草单位：湖南冠牧生物科技有限公司、上海市动物疫病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心、江西省农业生态与资源保护站、长沙海关检验技术中心、辽宁省动物疫病预防控制中心、榆林市农业宣传信息中心。

本文件主要起草人：杨忠苹、王涛、马丽、肖金年、杨德全、奉佳、陈桂平、禹思宇、刘林青、兰德松、白艳艳、李鑫。

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牛呼吸道合胞体病毒实时荧光RT-PCR检测方法

1范围

本文件描述了用实时荧光RT-PCR法检测牛呼吸道合胞体病毒。

本文件适用于牛鼻拭子、血样以及肺脏组织等样品中牛呼吸道合胞体病毒核酸的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录聚合酶链式反应（Real-timefluorescencereversetranscriptpolymerasechainreaction）

BRSV：牛呼吸道合胞体病毒（Bovinerespiratorysyncytialvirus）BHQ：无荧光淬灭基团（Blackholequencher）

Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（Cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

FAM：羧基荧光素（Carboxyfluorescein）

HEX：六氯-6-甲基荧光素（Hexachlorofluorescein）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline）

RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApoiymerase）

TEBuffer：Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTAbuffersolution）

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5原理

本文件采用了TaqMan探针实时荧光RT-PCR技术原理。反应体系中包括一对用于扩增的引物和

一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5′端标记了荧光报告基团，3′端标记了淬灭基团。在进行RT-PCR延伸反应时，首先将一条RNA链逆转录成为互补DNA，再以此为模板经过PCR进行DNA复制，Taq酶的5′外切酶活性将5′端荧光基团从探针上切割下来，使其与淬灭基团分离，从而仪器能检测到5′端荧光基团所发出的荧光信号，一分子PCR扩增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加，仪器检测到的荧光信号的累积反映了扩增产物量的变化。本文件以BRSV的M基因序列为基础设计合成了一对特异性引物及探针达到检测BRSV病原核酸的目的，同时在体系中引入人工合成的外源DNA片段作为外源内标，有效监控因试剂失效、操作错误、样本中存在PCR抑制物等原因带来的假阴性结果，建立了牛呼吸道合胞体病毒实时荧光RT-PCR反应体系。

6试剂和材料

6.1试剂

6.1.1除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求，所有试剂均用无

RNA酶的容器分装。

6.1.2Fast