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外源基因表达产物的纯化
生物与食品工程学院
蛋白质的纯化
n在研究蛋白质的分子结构、组成、生物学功能
和某些理化性质时,需要均一纯的甚至是结晶
的蛋白质样品
n分离纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质
之间各种性质的差异
n蛋白质分子的大小、形状
n溶解度,酸碱性质,吸附性质等等
蛋白质的理化性质
n蛋白质是由氨基酸组成的,
它具有某些与氨基酸有关
的性质。但它与氨基酸有
着质的区别,表现出单个
氨基酸所没有的性质
n等电点
nIsoelectricpoint,pI
n离子交换层析:利用各蛋白质的电
荷量及性质不同进行分离。
蛋白质的理化性质
n当蛋白质溶液处于某一pH时,蛋白质解离成正、
负离子的趋势相等,净电荷为零,此时溶液的
pH称为蛋白质的等电点。
n没有同种电荷的排斥,溶解度小,易聚集沉淀
各种蛋白的等电点不同,在同一pH时所带电
荷不同,在一电场作用下移动的方向和速度也
不同,所以可用电泳来分离提纯蛋白质。
n调整溶液pH,使不同等电点的蛋白质在各自等电点
pI处依次沉淀下来
蛋白质的理化性质
利用蛋白质选择性吸附的性质
n先吸附,再洗脱
qa.离子交换吸附:利用阴、阳离子树脂
qb.亲合色谱
n是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的层析类型
n将特殊结合分子固相化后,使存在液相中的相应蛋白质选
择性地结合在固相载体上,借以与液相中的其他蛋白质分
开,达到分离提纯的目的
n是一种利用生物大分子间专一的亲和力进行分离,分析和
纯化的色谱技术
蛋白质的理化性质
n蛋白质的大小和形状。
n离心:蛋白质的沉降速度
与分子大小和形状有关
n过滤(超滤)
n膜有各种不同的类型和规格
蛋白质的理化性质
n蛋白质的大小和形状
n凝胶过滤:又叫分子筛,
大分子随洗脱液从颗粒间
隙流下来,洗脱液体积小;
小分子在颗粒网状结构中
穿来穿去,历程长。
蛋白质的理化性质
n蛋白质的大小和形状。
n测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕
n以相对分子质量对数对Ve作图,得标准曲线
n再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕
蛋白质的理化性质
n沉淀
n蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的。
n条件改变,破坏了蛋白质溶液的稳定性,蛋白
质就会从溶液中沉淀出来。
q蛋白质在溶液中靠水化膜和电荷保持其稳定性,
化膜和电荷一旦被除去,蛋白质溶液的稳定性就被
破坏,蛋白质就开始粘在一起而形成较大的蛋白质
点,最后从溶液中沉淀出来,此现象即为蛋白质的
沉淀作用。
蛋白质的理化性质
n可逆沉淀:在温和条件下,通过改变溶液的pH
或电荷状况,使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。
蛋白质结构和性质都没有发生变化,可以重新
溶解形成溶液,是分离和纯化蛋白质的基本方
法,如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀
法等。
蛋白质的理化性质
n不可逆沉淀:在强烈沉淀条件下,不仅破坏了
蛋白质胶体溶液的稳定性,而且也破坏了蛋白
质的结构和性质,产生的蛋白质沉淀不可能再
重新溶解于水。
q加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉
淀等都属于不可逆沉淀
蛋白质的理化性质
n等电点沉淀
n盐溶、盐析作用(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)
q当盐浓度较低时,是蛋白质颗粒上吸附无机盐离子,加
强与水分子的作用,溶解度增加。
q当盐浓度很大时,一方面从蛋白质那里夺去水分,破坏
蛋白质表面的水化层;另一方面,由于盐的离子浓度比
较高,可以大量中和蛋白质颗粒上的电荷,从而容易聚
集而沉淀。
q不同的蛋白质盐析所需的盐浓度是各不相同的。因此,采用不同浓度盐溶
液使不同的蛋白质分段沉淀析出就可以达到分离目的。
透析法
n透析袋
n只用于去除盐类
和小分子杂
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