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外源基因表达产物的纯化

生物与食品工程学院

蛋白质的纯化

n在研究蛋白质的分子结构、组成、生物学功能

和某些理化性质时，需要均一纯的甚至是结晶

的蛋白质样品

n分离纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质

之间各种性质的差异

n蛋白质分子的大小、形状

n溶解度，酸碱性质，吸附性质等等

蛋白质的理化性质

n蛋白质是由氨基酸组成的，

它具有某些与氨基酸有关

的性质。但它与氨基酸有

着质的区别，表现出单个

氨基酸所没有的性质

n等电点

nIsoelectricpoint,pI

n离子交换层析：利用各蛋白质的电

荷量及性质不同进行分离。

蛋白质的理化性质

n当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、

负离子的趋势相等，净电荷为零，此时溶液的

pH称为蛋白质的等电点。

n没有同种电荷的排斥，溶解度小，易聚集沉淀

各种蛋白的等电点不同，在同一pH时所带电

荷不同，在一电场作用下移动的方向和速度也

不同，所以可用电泳来分离提纯蛋白质。

n调整溶液pH，使不同等电点的蛋白质在各自等电点

pI处依次沉淀下来

蛋白质的理化性质

利用蛋白质选择性吸附的性质

n先吸附，再洗脱

qa.离子交换吸附：利用阴、阳离子树脂

qb.亲合色谱

n是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的层析类型

n将特殊结合分子固相化后，使存在液相中的相应蛋白质选

择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分

开，达到分离提纯的目的

n是一种利用生物大分子间专一的亲和力进行分离，分析和

纯化的色谱技术

蛋白质的理化性质

n蛋白质的大小和形状。

n离心：蛋白质的沉降速度

与分子大小和形状有关

n过滤（超滤）

n膜有各种不同的类型和规格

蛋白质的理化性质

n蛋白质的大小和形状

n凝胶过滤：又叫分子筛，

大分子随洗脱液从颗粒间

隙流下来，洗脱液体积小；

小分子在颗粒网状结构中

穿来穿去，历程长。

蛋白质的理化性质

n蛋白质的大小和形状。

n测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕

n以相对分子质量对数对Ve作图，得标准曲线

n再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕

蛋白质的理化性质

n沉淀

n蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的。

n条件改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白

质就会从溶液中沉淀出来。

q蛋白质在溶液中靠水化膜和电荷保持其稳定性，

化膜和电荷一旦被除去，蛋白质溶液的稳定性就被

破坏，蛋白质就开始粘在一起而形成较大的蛋白质

点，最后从溶液中沉淀出来，此现象即为蛋白质的

沉淀作用。

蛋白质的理化性质

n可逆沉淀：在温和条件下，通过改变溶液的pH

或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。

蛋白质结构和性质都没有发生变化，可以重新

溶解形成溶液，是分离和纯化蛋白质的基本方

法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀

法等。

蛋白质的理化性质

n不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了

蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白

质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再

重新溶解于水。

q加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉

淀等都属于不可逆沉淀

蛋白质的理化性质

n等电点沉淀

n盐溶、盐析作用（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等）

q当盐浓度较低时，是蛋白质颗粒上吸附无机盐离子，加

强与水分子的作用，溶解度增加。

q当盐浓度很大时，一方面从蛋白质那里夺去水分，破坏

蛋白质表面的水化层；另一方面，由于盐的离子浓度比

较高，可以大量中和蛋白质颗粒上的电荷，从而容易聚

集而沉淀。

q不同的蛋白质盐析所需的盐浓度是各不相同的。因此，采用不同浓度盐溶

液使不同的蛋白质分段沉淀析出就可以达到分离目的。

透析法

n透析袋

n只用于去除盐类

和小分子杂