综合性试验蛋白质的分离提取SDS.ppt

综合性试验蛋白质的分离提取SDS;蛋白电泳及印迹技术（一）

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

;一、目的与要求

1.学习电泳原理和技术；

2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术；

;1.电泳的基本原理;

2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理

阴离子去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）可与蛋白质相互作用，破坏蛋白质分子的非共价键，使蛋白质变性，失去原有的空间构象，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，使各种蛋白质分子间原有的电荷差异被消除或大大降低，仅保留了分子大小的差异。

蛋白质分子在电场中的迁移速度仅仅取决于各自分子的大小。当与标准分子量的蛋白质相比较，可以得出各蛋白质分子的分子量大小。

;3.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：

(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；

(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；

(3)对pH和温度变化较稳定；

(4)几乎无吸附和电渗作用，只要丙烯酰胺纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；

(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度高，可达10-6g；

(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；

(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。;4.凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关

分离蛋白质或核酸的分子量范围与凝胶浓度的关系

分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)

蛋白质

?104 20-30

1-4×104 15-20

1-5×104-1×105 10-15

1×105 5-10

?5×105 2-5

核酸(RNA)

?104 15–20

104–105 5-10

105-2×106 2-2.6

;5.聚丙烯凝胶电泳的种类

聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。

目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。

;图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)

(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7

(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3

;图2夹心垂直板电泳槽及凝胶模示意图

;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的不连续体系

由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP（过硫酸铵）催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。

电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。;（1）样品浓缩效应

(a)凝胶孔径不连续性：

(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；

在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)

尾随离子(trailingion)或慢离子：甘氨酸根

mcl?clmp?pmG?G(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m?，m为迁移率，?