SNT 3496-2013 动物源性饲料中转基因成分实时荧光PCR检测方法.docx

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T3496—2013

动物源性饲料中转基因成分实时荧光PCR检测方法

Protocolofthereal-timePCRfordetectinggeneticallymodifiedcomponentinanimal-originated-feedstuffs

2013-03-01发布2013-09-16实施

中国家华质量人监检检总国局发布

I

SN/T3496—2013

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国农业大学、北京市畜牧兽医总站。

本标准主要起草人：刘建、林祥梅、朱振营、张永宁、王建武、吴绍强、郑海松、凌杏园、薛振华、张旻、于宁、王彩霞、李志辉、景宏丽。

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SN/T3496—2013

动物源性饲料中转基因成分实时荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了动物源性饲料中转基因成分的实时荧光PCR检验方法。

本标准适用于猪、牛、羊动物源性饲料中转基因成分实时荧光PCR检验。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

β2m:β2微球蛋白(β2-microglobulin)bp:碱基对(basepair)

CMV:巨细胞病毒(cytomegaloyirus)

Ct:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(qyclethreshold)dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate)

dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycyticinetriphosphate

dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deokyguanosinetriphosphate)

dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)

dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate)

DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)。

GFP:绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein)

NPTⅡ:新霉素-3-磷酸转移酶基因(neomyein-3-phosphotransferasegene)

PCR:聚合酶链反应(polymerasechainreaction)

SV40:猿猴空泡病毒40(SimianVacuolatingvirus40)Taq酶：DNA聚合酶。

TE:Tris-HCI、EDTA缓冲液

Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)

4实验方法

4.1主要仪器

4.1.1实时荧光定量PCR仪。

4.1.2超净工作台。

4.1.3消毒灭菌锅。

4.1.4旋涡振荡器。

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4.1.5高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。

4.1.6低温冰箱。

4.1.7纯水器，双蒸水器。

4.2主要试剂

除另有规定外，所有试剂均采用分析纯或生化试剂。

4.2.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。

4.2.2PCR缓冲液。

4.2.3氯化镁(MgCl?)。

4.2.4dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)。

4.2.5Taq酶。

4.2.6其他药品及试剂配制方法见附录A。

4.3引物和探针

按照表1中提供的引物及探针序列合成引物及探针(参见附录B),加入无离子水配成100pmol/μL贮存，配成直接用于PCR反应的10pmol/pL的工作液。

表1检测转基因动物内、外源基因所需的引物及探针序列

被检测基因

基因来源

引物序列

探针序列

备注

牛β2m

牛内源

5-CTGCTATGTGTATGGGTTCC-3’5’-GTAGAAAGACCAGTCCTTGC-3’

5-AGACAGGTC