遗传工程动物模型.ppt

第31页,共54页，星期六，2024年，5月打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种2.基本程序第32页,共54页，星期六，2024年，5月InjectionofES

cellsintoblastocysts第33页,共54页，星期六，2024年，5月外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。3.优点第34页,共54页，星期六，2024年，5月ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。4.缺点第35页,共54页，星期六，2024年，5月遗传病研究肿瘤的研究生物制药5.在医学中的应用第36页,共54页，星期六，2024年，5月（三）反转录病毒法（四）精子载体法第37页,共54页，星期六，2024年，5月第38页,共54页，星期六，2024年，5月细胞核移植法第39页,共54页，星期六，2024年，5月转基因动物是在单细胞基因转染技术的基础上发展起来的。而许多基因的表达是无法通过转染的方法来研究；基因表达有时空与组织的特异性；外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；因此，只有通过转基因的动物才有可能研究基因的表达、调控及基因之间的相互作用。四转基因动物的意义第40页,共54页，星期六，2024年，5月进行功能基因组学的研究，研究外源基因在动物整体水平的表现调控规律。转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究。也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要。还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。第41页,共54页，星期六，2024年，5月第三节ENU诱变小鼠ENU致突变技术是高通量大规模筛选新基因及发育突变技术的化学方法：当人们还不能获得ES细胞时，小鼠遗传学家最常用的方法是用乙烷基亚硝基脲（ENU)处理公鼠，然后在后代中筛选显性或隐性突变的小鼠。随着越来越多的基因和微卫星标记被定位，突变基因的定位也随之变得容易；因此对小鼠进行化学诱变将越来越变得低成本而高效益。第42页,共54页，星期六，2024年，5月一、ENU诱变的技术路线1.ENU诱变的简单流程ENU处理雄性C57BL/6小鼠，10周后与同品系母鼠配种，Fl离乳时筛查，阳性突变小鼠留种，与同品系正常母鼠配种，Fl有亲代突变表型者留种(为显性遗传)，基因定位、培育新的模型、基因克隆、基因功能研究。隐性突变筛选需由Fl互交或F2回交Fl，发现突变表型者留种，进行进一步的研究。第43页,共54页，星期六，2024年，5月2．显性突变的筛选10周龄的雄性小鼠按150mg/kg体重的剂量腹腔注射ENU，60天后待处理公鼠恢复生殖能力后与野生型雌性配种，通过对F1代小鼠进行形态学、行为学、血液学、生理生化等指标的检测，可筛选基因的显性突变。3．隐性突变的筛选基因隐性突变的筛选需将F1代的雄性鼠与野生型雌性小鼠交配，再将F1代雌性小鼠与F1代雄性鼠回交或F2代雌、雄鼠交配，获得F3代小鼠，并将F3代小鼠用于大规模筛选。第44页,共54页，星期六，2024年，5月4．基因驱动法与表型驱动法相结合的ENU诱变筛选单基因剔除是典型的基因驱动的研究。研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的打靶载体以及筛选中靶ES细胞等。通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要1年或更长的时间。面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因剔除方法显得力不从心，不符合现代生物学高通量、大规模筛选的要求。第45页,共54页，星期六，2024年，5月用放射线导致缺失和突变以及用各种化学诱变剂诱导点突变等许多经典的遗传学研究属于表型驱动的研究。早在20世纪90年代初，研究者就提出带有第7号染色体缺失的小鼠可用来筛选ENU诱导的缺失区域内的点突变。基因打靶的研究进展使得研制携带染色体组任意片段的缺失、倒位或者易位突变小鼠成为可能。RamirezSolis应用位点特异的重组酶系统首次在小鼠ES细胞中实现了最长3～4cM染色体组片段的缺失、倒位和重复。并采用同源重组技术构建了大片段染色体缺失的基因剔除小鼠。第46页,共54页，星期六，2024年，5月将基因打靶这种基