基因诊疗专业知识培训专家讲座.pptx

基因诊疗

GeneDiagnosis;

疾病根本原因:

疾病各种表型改变

是基因改变造成。;基因诊疗:

采取分子生物学技术方法来分析受检者某一特定基因结构(DNA水平)或功效(RNA水平)是否异常，以此来对对应疾病进行诊疗。是病因诊疗。

检验基因存在、缺点或表示异常，对人体状态和疾病作出诊疗方法和过程。

;基因诊疗原理;第一节基因诊疗技术方法;一、基因诊疗中惯用分子生物学技术;核酸分子杂交：按照碱基互补配对标准，将不一样起源序列互补单链DNA/DNA，RNA/RNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。;一、原位分子杂交技术

DNA变性:

当溶液中DNA分子处于高温或高pH值(13)条件下,

维持双螺旋在一起碱基互补对就被破坏,DNA双链解离

成两条单链,这一过程叫DNA变性。

DNA复性:

当温度降低至适当温度或恢复pH值至中性，两条裂

解单链按碱基互补配对标准重新形成双链结构,这一

过程叫DNA复性,又叫DNA杂交。;;原位杂交：用核苷酸探针对特殊核苷酸次序在其原位进行

(insituhybridization)杂交,叫原位杂交。可用于DNA、RNA定位研究。;荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）;印迹技术类别及应用;Southern印迹杂交用于基因探测基本过程

Southern印迹杂交惯用于探测DNA限制性内切酶图谱。经过检测某个体特定基因及旁侧区域限制性内切酶图谱改变，可判断是否发生了显著DNA突变。详细方法图示以下：;组织或细胞;三种印迹技术比较;分子杂交试验;放射自显影照片;核酸分子杂交;;取得满意高特异性杂交关键是控制好杂交条件和杂交后冲洗条件。杂交双链稳定程度主要由其Tm值（熔解温度）决定。影响杂交双链Tm值原因包含以下几个方面：

;在液相体系中，完全配正确核酸双链Tm值能够以下公式预计：;寡聚核苷酸

Tm(0C)＝2（AT碱基对数）＋4（GC碱基对数）（适合用于10～30bp）

Tm(0C)＝81.5+0.41×(G-C)%+16.6×logM－600/L（适合用于14～70bp）

?

其中M为单价阳离子（通常为Na+）浓度,L为杂交双链长度，以碱基对计算。这些公式适合用于0.01~0.4mol/LNa+浓度及30－75GC％。

?

在无变性剂存在条件下，最适杂交发生在比DNA/DNATm低20－250C，比DNA/RNATm低10－150C。

在固液体系中，杂交条件对杂交双链Tm值影响更为复杂，普通低于按上述公式得到计算值。

;(二)聚合酶链式反应

（PCRpolymerasechainreaction)

;详细过程：

①变性：将双链DNA加热（95℃）使之变性，DNA双链

变成单链

②退火：降低温度至56℃使引物与模板DNA单链结合

③延伸：将温度升至72℃，在DNA聚合酶作用下，在引

物3’端进行延伸，使原模板DNA一条链变成

两条链。;5?;Cycle3;模板DNA

特异性引物

耐热DNA聚合酶

dNTPs

Mg2+;（3）、PCR基本反应步骤;（三）、单链构象多态性(SSCP)分析

;PCR/单链构象多态性分析（SSCP）;;四、限制酶酶谱分析;㈤DNA序列测定;DNA芯片(DNAchip)

cDNA芯片(cDNAchip)

是指将许多特定DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积支持物上。;;二、基因诊疗基本方法;㈠基因突变诊疗;;;2.大片段丢失或插入诊疗

外侧确定有没有缺失及缺失片断相对大小

内侧确定缺失部位.

;㈡多态性连锁分析;;;㈢基因表示异常诊疗;㈣外源DNA检测;第二节基因诊疗应用;;一、遗传性疾病;×;;遗传性疾病----DMD分子诊疗;DMD基因外显子缺失检测;二、感染性疾病基因

诊疗策略;SARS相关冠状病毒分子诊疗;年4月，德国汉堡Bernhard-

Nocht热带医学研究所学者Drosten

等用随机扩增技术，取得长度为

300bp核苷酸序列。

依据这段序列，建立了检测新冠状

病毒常规和实时定量PCR技术。（