食品中马克斯克鲁维酵母的定性检验 PCR法（征求意见稿）.docx

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T/SSFSXXXX—2024

食品中马克斯克鲁维酵母的定性检验PCR法

1范围

本文件规定了食品中马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus）的定性检验方法（PCR法）。

本文件适用于含马克斯克鲁维酵母的发酵乳、饮料、干酪、乳粉及发酵剂等产品中马克斯克鲁维酵母的定性检验。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.35食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

马克斯克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus

属于子囊菌门、酵母菌亚门、酵母纲、酵母目、酵母科、克鲁维属。菌体呈椭圆形、卵形或结肠形，好氧或兼性厌氧的异养型单细胞真核生物。

3.2

聚合酶链式反应polymerasechainreaction,PCR

模板DNA先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）为底物，使退火引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数。

3.3

缩略词

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）。

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）。

Taq酶：从水生栖热菌ThermusAquaticus中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）。

bp：碱基对（basepair）。

ITS：内部转录间隔区（internaltranscribedspacer）。

4仪器和设备

除微生物实验常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

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4.1电子天平：感量：0.001g。

4.2PCR扩增仪。

4.3高速台式冷冻离心机：0~20000r/min。

4,4紫外凝胶成像仪。

4.5电泳装置：包括电泳槽及电泳仪。

4.6微量可调移液器及相应可调吸头。

4.7恒温水浴锅：37℃±2℃和70℃±2℃。

4.8微波炉。

4.9超净工作台。4.10高压灭菌锅。4.11涡旋振荡仪。

4.12冰箱：2℃~8℃、-30℃~-20℃。

5试剂和材料

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或符合生化试剂，实验用水为GB/T6682规定的一级水，试剂如不做特别说明的均为常温保存。

5.10.1mol/L磷酸钠缓冲液：见附录A.1.1。5.21.2mol/L山梨醇缓冲液：见附录A.1.2。5.320%柠檬酸三钠溶液：见附录A.1.3。

5,41mol/L氢氧化钠溶液：见附录A.1.4。

5.51×TAE缓冲液：见附录A.1.5。

5.6无菌超纯水或无菌双蒸水。

5.7PCR混合试剂：包括ExTaqDNA聚合酶、dNTPs混合液、10×PCR缓冲液（含Mg2+）、引物，于-20℃保存。

5.8DNA分子量标记物（MarkerDL2000），于4℃保存。5.9电泳上样缓冲液，于4℃保存。

5.10商品化的酶法破壁酵母基因组DNA提取试剂盒（内含缓冲液GA及GB，蛋白酶K，漂洗液GD及PW，洗脱液TE）。

5.11溶壁酶（10U/μL），于-20℃保存。

5.12无水乙醇。

5.131%琼脂糖凝胶：见附录A.1.6。

5.144SGreen染料，于4℃保存。

5.15无菌离心管：包括1.5mL、2.0mL、15.0mL。

5.16无菌PCR反应管。

5.17乳酸克鲁维酵母CICC32402T菌株或其他等效参考菌株。

5.18马克斯克鲁维酵母CGMCC10060菌株或其他等效参考菌株。

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