GB∕T 36789-2018 动物狂犬病病毒核酸检测方法.docxVIP

ICS11.220

B41

中华人民共和国国家标准

GB/T36789—2018

动物狂犬病病毒核酸检测方法

Nucleicaciddetectionofanimalrabiesvirus

2018-09-17发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

发布

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GB/T36789—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位：军事医学科学院军事兽医研究所。

本标准主要起草人：冯烨、郭焕成、许运斌、江禹、涂长春。

Ⅱ

GB/T36789—2018

引言

本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及4.4与套式RT-PCR检测方法相关的专利的使用。

本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：

专利持有人姓名：江禹、涂长春

地址：吉林省长春市净月经济开发区柳莺西路666号军事医学科学院军事兽医研究所

请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

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GB/T36789—2018

动物狂犬病病毒核酸检测方法

1范围

本标准规定了检测动物狂犬病病毒核酸的套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法。

本标准适用于临床疑似狂犬病病毒感染动物脑组织、脊髓、脑脊液、唾液腺、唾液以及狂犬病病毒细胞培养物中病毒核酸的检测(参见附录A)。

2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(Reverse-TranscriptionPolymeraseChainReaction)DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)

RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)

DEPC:焦炭酸乙二酯(Diethypyocarbonate)

PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution)Ct值：达到阈值的循环数(CycleThreshold)

EDTA:乙二胺四乙酸(EthyleneDiaminetetraaceticAcid)

dNTP:三磷酸脱氧核糖核苷(Deoxy-RibonucleosideTriphosphate)Taq酶：耐热DNA聚合酶(ThermusAquaticusPolymerase)

3器材和试剂

3.1器材

3.1.1仪器

IⅡ级生物安全柜、4℃离心机、冰箱(-20℃)、冰柜(4℃)、分析天平、PCR扩增仪、荧光定量PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、微波炉、震荡混匀器、组织研磨器、单道可调移液器(10μL、200μL、1000μL)。

3.1.2耗材

手术剪、医用镊子、称量纸、棉签、琼脂糖、量简(500mL)、锥形瓶(500mL)、一次性无RNase枪头(10μL,200μL,1000μL)、无RNase离心管(1.5mL)、与荧光定量PCR扩增仪配套的PCR管(0.2mL)、组织研磨棒。

3.2试剂

3.2.1总RNA提取试剂。

3.2.2磷酸盐缓冲液(1mol/LPBS,pH7.4)。配制方法见附录B。

3.2.3TAE电泳缓冲液。配制方法见附录B。

3.2.4其他试剂：200IU/μL反转录酶、10×反转录酶缓冲液、40U/μLRNA酶抑制剂、5IUTag酶、

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GB/T36789—2018

10×Taq缓冲液(含Mg2+)、2.5mmol/LdNTPs、50μmol/L寡聚脱氧胸苷酸引物[Oligo(dT)1?Prim-

er]、50μmol/L随机引物、25mmol/L氯化镁(MgCl?)、10%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、核酸染料、上样缓冲液、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇、双蒸水、DEPC水。

3.2.5引物及探针序列，见附录C。

4方法

4.1样品的采集、保存和运