预混合饲料中d-生物素的测定 征求意见稿.docx

4.3仪器设备

GB/T17778－202×

预混合饲料中d-生物素的测定

1范围

本文件描述了预混合饲料中d-生物素的分光光度和高效液相色谱测定方法。本文件适用于复合预混合饲料、维生素预混合饲料中d-生物素的测定。

本文件分光光度法的检出限为4mg/kg、定量限为12mg/kg，高效液相色谱法的检出限为2mg/kg、定量限为6mg/kg。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制样

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4方法1——分光光度法

4.1原理

用无水乙醇将试样中d-生物素提取出来，在硫酸乙醇溶液中d-生物素和4-二甲基氨基肉桂醛生成橙色化合物，在530nm处颜色深浅与d-生物素含量成正比。

4.2试剂或材料

警示：强酸应小心操作，取用均需在通风橱中进行。

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

4.2.1水：GB/T6682，一级。

4.2.2硫酸乙醇溶液：将2体积的硫酸与98体积的无水乙醇混匀。

4.2.34-二甲基氨基肉桂醛无水乙醇溶液：2g/L。

4.2.4标准储备溶液（1mg/mL）：准确称取d-生物素（纯度≥98%）标准品适量（精确至0.01mg）

于50mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，混匀。于4℃保存，有效期为3个月。

4.2.5标准工作溶液（20μg/mL）：准确移取d-生物素标准储备溶液（4.2.5）1mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，混匀。于4℃保存，有效期为2个月。

GB/T17778－202×

4.3.1分光光度计：±1nm。

4.3.2分析天平：精度0.01mg、0.1mg。

4.3.3超声清洗器。

4.4样品

按GB/T20195制备试样，至少200g，充分混匀，装入棕色磨口瓶中保存，备用。

4.5试验步骤

4.5.1试样溶液的制备

称取维生素预混料2g（精确至0.0001g）、复合预混合饲料5g~10g（精确至0.0001g），置于50mL容量瓶中，加入30mL无水乙醇置于超声清洗器（4.3.3）中超声20min，用无水乙醇定容至刻度。过滤备用。

4.5.2测定

4.5.2.1标准工作曲线的绘制

精确吸取d-生物素标准工作溶液（4.2.5）0.00mL、0.80mL、1.60mL、4.00mL、6.40mL、8.00mL于20mL容量瓶中，分别加入无水乙醇8.00mL、7.20mL、6.40mL、4.00mL、1.60mL、0.00mL，加入硫酸乙醇溶液（4.2.2）2mL和4-二甲基氨基肉桂醛无水乙醇溶液（4.2.3）2mL，摇匀，室温下放置1h，用无水乙醇（4.2.1）稀释至刻度，混匀。用1cm比色皿在530nm波长处测定吸光度，以d-生物素的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。

4.5.2.2样品测定

精确吸取试样提取液（4.5.1）8.00mL于20mL容量瓶中，加入硫酸乙醇溶液（4.2.2）2mL和4-二甲基氨基肉桂醛无水乙醇溶液（4.2.3）2mL，摇匀，室温下放置1h，用无水乙醇（4.2.1）稀释至刻度，混匀。用试剂空白作为参比溶液，用1cm比色皿在530nm波长处测定吸光度。试样溶液中d-生物素的质量浓度应在标准曲线的线性范围内，若超出线性范围，应将试样溶液用无水乙醇稀释后，重新测定。单点校准定量时，试样溶液中d-生物素的质量浓度与标准溶液质量浓度相差不超过30%。

4.6试验数据处理

试样中d-生物素的含量，以质量分数w1表示，单位为毫克每千克（mg/kg），多点校正按公式（1）计算，单点校正按公式（2）计算：

w1=×n………（1）

式中：

ρ1——从标准曲线查得的试样溶液中d-生物素质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL）；m——试样质量，单位为克（g）；

V1——试样提取液的总体积，单位为毫升（mL）；

V2——从提取液（V1）中分取的溶液体