DB13T 2456-2017 番茄苗期抗黄化曲叶病 毒基因快速检测技术规程.docx

ICS67.080.01B31

DB13

河北省地方标准

DB13/T2456—2017

番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因快速检测技术规程

2017-03-29发布2017-06-01实施

河北省质量技术监督局发布

DB13/T2456—2017

I

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北省农林科学院提出。

本标准起草单位：河北省农林科学院经济作物研究所。

本标准主要起草人：吴志明、李亚栋、耿保进、高慧敏、田玉、孙英焘、孙世卫、寇慧苹、冯贺敬。

DB13/T2456—2017

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番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因快速检测技术规程

1范围

本标准规定了番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因的检测前准备和检测技术。

本标准适用于番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因Ty-1、Ty-2、Ty-3/3a的分子快速检测。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。2.1

番茄黄化曲叶病毒病（Tomatoyellowleafcurlvirusdisease）

为病毒性病害，病原为番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCVorTY），病原特征及发病症状见附录C。

2.2

番茄抗黄化曲叶病毒基因2.2.1

番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-1

定位在番茄第6号染色体上(基因号)。2.2.2

番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-2定位在番茄第11号染色体上。

2.2.3

番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-3/3a定位在番茄第6号染色体上。

3检测前准备

3.1检测仪器

组织研磨仪、恒温水浴锅、离心机、高压灭菌锅、移液器、称量天平、冰箱(4℃、-20℃、-80℃)、电泳仪、紫外凝胶成像仪、PCR仪等。

3.2检测试剂

DNA提取液(CTAB)、氯仿/异戊醇(24/1)、乙醇、异丙醇、蒸馏水、双蒸馏水（ddH2O）、TE缓冲液(Ph=8.0)、50xTAE缓冲液、Goldview、DM2000、琼脂糖、Taq酶等。

3.3检测引物

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表1给出了抗TYLCV的抗病基因扩增引物。

表1Ty-1、Ty-2和Ty-3/3a检测引物

基因

染色体

引物

序列(5′-3′)

扩增产物(bp)

标记类型

Ty-1

6

Ty1正向

TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTC

984（抗）

1434（感）

SNP

Ty1反向

AATGGTGACAGAATCAAGATCCAC

Ty1-3

AAACGCTCTTCTTCCCCTCG

Ty1-4

AGTTAGATTCAGGCTCCTCGCA

Ty-2

11

Ty2正向

AAAATGTTCGTCTCTTTTAATCATAC

194（抗）

494（感）

SCAR

Ty2反向

AGTGTACATCCTTGCCATTGACT

Ty-3/3a

6

Ty3正向

GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC

Ty3450（抗）

320（感）

SCAR

Ty3反向

GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC

Ty3a630（抗）

3.4DNA提取液配制

配制以下DNA提取液：

a)100mmol/LTris(pH=8.0)；

b)50mmol/LEDTA；

c)500mmol/LNaCl；

d)2%CTAB（W/V）；

e)0.8%皂土（W/V）。

4检测技术

4.1样品采集和保存

采集定植前番茄苗至少3个样本，每个样本随机选取3～5株，进行编号、保存。短期保存温度4℃,长期保存温度-20℃或-80℃。

4.2DNA提取

DNA提取按下列步骤进行：

a)在2mL离心管加入0.2g左右样本、一粒磨样珠，用磨样机研磨成匀浆；

b)加入600μl65℃预热的DNA提取液，65℃保温30min以上；

c)加入600μl氯仿/异戊醇（24/1），上下颠倒混匀数次，室温静置5min；

d)6000rpm以上室温离心10min，吸取上清液400μL至1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置5min；

e)10000rpm以上离心10min，弃上清液；

f)加入1ml70%乙醇洗涤，用手指轻弹使沉淀漂浮于乙醇中；

g)6000rpm以上离心5min，弃上清液，将离心管倒扣在滤纸上，风干DNA；

h)加入