SNT 1611-2013 南方菜豆花叶病毒血清学检测方法.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T1611—2013

代替SN/T1611-2005

南方菜豆花叶病毒血清学检测方法

SerologicaldetectionmethodsofSouthernbeanmosaicvirus

2013-11-06发布2014-06-01实施

中华人民共和国

国家质量监督检验检疫总局

发布

I

SN/T1611—2013

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准代替SN/T1611—2005《南方菜豆花叶病毒血清学检测方法》。本标准与SN/T1611—2005相比，主要技术变化如下：

——增加了免疫电镜检测方法；

增加了免疫捕获RT-PCR验证方法；

增加了南方菜豆花叶病毒相关资料的附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：于翠、杨翠云、胡培龙、陶庭典、印丽萍。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

SN/T1611—2005

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SN/T1611—2013

南方菜豆花叶病毒血清学检测方法

1范围

本标准规定了植物检疫中南方菜豆花叶病毒基于血清学的DAS-ELISA、免疫电镜和免疫捕获RT-PCR等检测方法。

本标准适用于进出境豆科植物种子、苗木及传毒介体中南方菜豆花叶病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样

SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法

3南方菜豆花叶病毒基本信息

中文名：南方菜豆花叶病毒

异名：菜豆花叶病毒4号Beanmosaicvirus4;南方菜豆花叶病毒1号Southernbeanmosaicvirus1;菜

豆南方花叶病毒Beansouthernmosaicvirus。英文名：Southernbeanmosaicvirus

分类地位：南方菜豆花叶病毒属Sobemovirus

传播途径：病毒可能以循环型方式由叶甲传播。菜豆种传机率1%～5%,豇豆种传机率为5%~

40%。实验中易于机械接种传播。

该病毒的其他相关资料参见附录A。

4原理

SBMV是直径约30nm的球状粒子，为有效的免疫源，可制备高效价的抗血清。在此基础上建立

了DAS-ELISA和免疫电镜检测方法。病毒为单分体基因组，根据保守序列设计特异性引物，建立了免

疫捕获RT-PCR验证方法。

5仪器设备和主要试剂

5.1仪器设备

PCR仪、酶标仪、洗板机、电子天平(感量1/1000g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、台式小型离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、旋涡振荡器。

5.2试剂

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。南方菜豆花叶病毒血清学检测试剂盒、RNA反转

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SN/T1611—2013

录酶、PCR缓冲液、dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、TaqDNA聚合酶、DNA分子标记、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。试剂配制见附录B。

6检测鉴定方法

6.1样品制备

6.1.1待测样品为小苗时，挑选有疑似症状的植物的不同部位研磨后加入抽提缓冲液，离心取上清待用。没有症状或无法观察症状的植物产品，应按比例取样。抽样比例及方法见SN/T2122,症状描述

参见附录A。

6.1.2待检测的样品为种子时，挑选表皮皱缩、变小的种子研磨器打碎后加入样品抽提缓冲液，充分浸泡后离心取上清待用。

6.2双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)

6.1制备的上清液用于DAS-ELISA检测。同时，设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照(如种子或叶片)应尽量与所检测样品类型相一致。具体操作过程见附录C。

6.3免疫捕获RT-PCR检测(IC-RT-PCR)

PCR管包被南方菜豆花叶病毒抗血清后，加入6.1制备的上清液，进行免疫捕获。IC-RT-PCR具体操作步骤见附录D。

6.4免疫电镜检测

按照SN/T1840中的方法进行电镜观察。如观察到直径为30nm的球状病毒粒子，即可判定免疫电镜结果阳性。

7结果判