NYT 2258-2012 香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范.docxVIP

ICS65.020B16

中华人民共和国农业行业标准

NY/T2258—2012

香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范

Moleculardetectionforpathogenofbananablackleafstreakdisease

2012-12-07发布2013-03-01实施

中华人民共和国农业部发布

I

NY/T2258—2012

前言

本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由农业部农垦局提出。

本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。

本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。

本标准主要起草人：谢艺贤、漆艳香、张欣、蒲金基、张贺、陆英、张辉强。

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NY/T2258—2012

香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范

1范围

本标准规定了香蕉黑条叶斑病原菌(MycosphaerellafijiensisMorelet)分子检测方法。

本标准适用于香蕉种苗及大田植株上的黑条叶斑病原菌的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所的修改单)适用于本文件。

SN/T1193基因分析检测实验室技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件

3.1

香蕉黑条叶斑病bananablackleatstreakdisease

由斐济球腔菌(Mycosphaerellaen.isMorelet)引起的一种为害香蕉叶甘的检疫性真菌病害。

该病害病原菌的分类地位寄主范围、地理分布及其为害症状见A4、A.6、A7和A.8。

3.2

核糖体基因内转录间隔区ribosomalDNAinternaltranscribedspacers,rDNA-ITs真核生物核糖体基因内转录间隔区(rDNA-ITS声通常包括ITSI.5.8S和Ys2

3.3

聚合酶链式反应polymerasechainreaction,PCR

模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链土相应的一段互补序列发生退火而互相结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。

4原理

根据香蕉黑条叶斑病原菌核糖体基因内转录间隔区(rDNA-ITS)特有碱基序列设计特异性引物进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期1009bp的DNA片段，判断样品中是否携带香蕉黑条叶斑病原菌。

5仪器设备及试剂

见B.1和B.2。

6取样

按附录A描述的症状仔细检查香蕉叶片，发现香蕉黑条叶斑病疑似症状，即取叶片200g以上，装入牛皮纸袋中，送实验室检测。

7显微观察

从疑似病样病斑上挑取或用透明胶粘取灰色霉状物制成临时玻片进行镜检，观察有无类似斐济球

2

NY/T2258—2012

腔菌的分生孢子存在。

8PCR检测

8.1PCR反应模板制备

见B.4.1。

8.2PCR反应

在PCR薄壁管中分别加入以下试剂(25μL体系)后进行PCR反应：1pL基因组DNA,10×PCR缓冲液(Mg2+Plus)2.5μL,脱氧核糖核苷酸(dNTP)混合物2μL,特异性引物(见表1)各0.5μL,Taq酶0.2μL,无菌超纯水18.3μL。

表1PCR反应的引物及扩增产物

引物名称

引物序列

预期扩增产物

MF137

5-GGCGCCCCCGGAGGCCGTCTA-3

1.009bp

R635

5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3

反应条件：94℃预变性3min;后30个循环为94℃变性45s至60s;62℃退火45s至60s;72℃延伸1min;最后72℃延伸5min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存，存放时间不超过24h。

8.3反应体系中对照的设置

8.3.1阳性对照

用香蕉黑条叶斑病原菌基因组DNA作为模板。

8.3.2样品对照

用健康香蕉组培苗提取的基因组DNA作为模板。

8.3.3PCR反应体系对照

用配制反应体系的无菌超纯水代替DNA模板，检