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3DNA的复制与修复;DNA双螺旋结构模型的建立为DNA自我复制机制做了初步解释,即碱基互补——两条链互补,碱基配对——模板式复制。
DNA复制机理的复杂性
D.S.DNA→S.S.DNA能量的供求
构型的变化:超螺旋→线状、开环状
多种酶类的互作→Replisome;复制的准确性(修复,校正)
DNA复制速度(E.coli105bp/min,高速解旋112km/h?)
DNA复制模式不统一(dsDNA、sDNA、LinearDNA….)
DNA复制起始控制机理;3.1DNA复制概述;3.1DNA复制概述;3.1.1DNA复制研究选材;②噬菌体(phage)是研究复制机制的一个重要实验系统。
优点:基因组小,易操作;DNA分子有线形、环形、单链和双链形式,可代表不同类型DNA的复制。如:线型,θ式,D型等复制。
已研究过的典型噬菌体系统:Phageφx174、T4等。;Watson和Crick发表了DNA双螺旋模型之后又发表了DNA半保留复制(semiconservativereplicationmodel)模型,这一建立在碱基互补基础上的机制,为DNA的转录、修复、和分子杂交等奠定了基础。;DNA复制(replication)是在亲代双链DNA分子的每一条链上按碱基互补配对而准确地合成一条新的互补链,结果生成两个与亲代链相同的DNA双链的过程。;在半保留复制模型提出之前,普遍认为“蛋白质和核酸是彼此互补的,DNA自我复制过程是通过核酸和蛋白质的交替合成”。但Watson和Crick认为DNA自我复制时亲本链保持不变,但双链分开,每个亲本链作为复制的模板,子代双链含有一条亲本链和一条新合成的链。这就是DNA复制的半保留模型。;当时人们对半保留模型是持怀疑态度的,因双螺旋模型中存在最大的问题是双链是如何打开的?其所需的能量从何而来?Watson和Crick也承认这是“最大的问题”。
人们为了避开打开双链这个难题,又提出了全保留复制(conservativereplicationmodel)和分散(dispersivemodel)两个模型。;在全保留模型中两条母链彼此结合,恢复原状,新合成的两条子链彼此互补结合形成一条新的双链。在分散模型中亲代双链被切成双链片段,而这些片段又可作为新合成双链片段的模板,新、老双链片段又以某种方式聚集成“杂种链”。后来通过实验证实其中半保留模型是正确的。;DNA复制的3种假说;3.1.2.1半保留复制;3.1.2.2半保???复制的证据;1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N标记DNA,而不用放射性同位素32P和14C。15N会导致DNA分子密度显著增加,这样可通过密度梯度离心将亲本链和子代链区分开来。;将大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长15代,使DNA被15N标记后,再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。分别取0代、1代、2代、3代的细胞,提取DNA,进行密度梯度离心,分辨重链DNA、正常的轻链DNA和包含一条重链和一条轻链的DNA“杂种链”。;离心后从管底到管口DNA分子就停留在与其相当的CsC1密度处,紫外光下可以看到形成的区带。
14N-DNA密度较轻,停留在离管口较近的位置;15N-DNA密度较大停留在较低的位置。;当含有15N-DNA的细胞在14NH4C1培养液中培养1代后,只有一条区带介于14N-DNA与15N-DNA之间。
培养2代后则在14N-DNA区又出现一条带。有等量的“杂种链”和轻链密度。这些结果只与半保留复制模型相符。全保留模型可以排除,但分散模型却不能排除。;Meselson等又将第1代的14N/15N杂种链变性使双链分开,再将变性前后的双链和单链分别进行CsCl密度梯度离心。变性前杂种双链只有一种带,密度为1.717g/cm3,变性后两条单链的密度不同而呈现了两条带,一条为15N带,(1.740g/cm3),另一条为14N带(1.725g/cm3)。作为对照的是从肺炎球菌(S.pneumoniae)中提取的DNA,变性前后都只有一条带,密度为1.700g/cm3。这一结果完全符合半保留复制预期的结果,并否定了全保留模型和分散模型。;按照半保留复制方式培养两代,只能出现14N和14N/15N两种DNA分子,随着代数的增加14N-DNA逐渐增加。而14N-15NDNA区带逐渐减弱。;②Taylor的实验
真核细胞的每条染色单体是由一条DNA双链组成,1958年HerbertTaylar用3H的胸腺嘧啶核苷酸处理蚕豆根尖细胞8小时,然后移入含有秋水仙素而没有标记放射性的培养液中。经标记处理后第一次分裂中期的染色体周围均显示放射性,每个染色体中有一条染色单体被标记,另一条染色单体未被标记。第二次
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