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CRISPR/Cas9基因编辑技术综述

作者：钦越陈志杨章平

来源：《河南农业·教育版》2021年第07期

摘要：CRISPR/Cas9首次在细菌中被发现，是适应性免疫系统的一部分，现已广泛用于工

程改造基因组中激活或抑制基因表达。同时，CRISPR/Cas9有望通过提供一种有效的技术来剖

析癌症发生的机制，确定药物开发的靶标，并可能为基于细胞的疗法提供支撑以加速癌症的研

究。对CRISPR/Cas9技术的发展历史和应用范围做了概述及展望，以期为CRISPR/Cas9技术

的后续发展提供思路。

关键词：CRISPR/Cas9;基因编辑;哺乳动物

长期以来，基因疗法一直被寄予希望可以治疗或纠正人和动物体内的各种疾病和缺陷。随

着簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）的发现、基于CRISPR的原核生物适应性免疫系

统（CRISPR相关系统，Cas）的机制以及它的再利用成为一种有效的基因编辑工具，使得分

子生物学领域发生了革命性的变化，并激发了人们对新的和改进的基因治疗的兴趣。

CRISPR/Cas9（规律性成簇间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）系统是继ZFN、

TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，是现有基因编辑和基因修饰里面效率

最高、最简便、成本最低的技术之一，已成为当今最主流的基因编辑系统。

一、CRISPR/Cas9系统的起源

1987年，日本科学家在研究大肠杆菌的时候发现其基因组上有一段29bp的序列反复出现

了数次且彼此之间被一段32bp的序列所隔开。1993年，西班牙科学家FranciscoMojica在地中

海噬盐菌中也同样发现了这段重复序列。随着后续的研究，他在二十多种不同的微生物体内都

发现了这种重复DNA结构，并将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered

RegulationInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR）。通过对比多种细菌的几千段

CRIPSR序列，发现在CRIPSR序列中存在许多片段与病毒的基因组序列高度一致，虽然不是

完整的病毒基因组序列，但这些序列被夹在一段细菌精心设计的重复序列中。进一步的研究证

实，这些与病毒基因组高度一致的序列来自于噬菌体。2007年，CRISPR序列对于细菌免疫系

统的功能在嗜热链球菌中得以证明。

2011年，美国化学家詹妮弗，杜德纳与法国生物化学家埃马纽埃尔，卡彭蒂耶合作开发

CRISPR技术，并于一年后在《Science》杂志中首次指出，CRISPR/Cas9系统在体外实验中能

定点对DNA进行切割，显著提升了基因编辑的效率。2013年，哈佛大学医学院教授乔治。彻

奇和华人科学家、麻省理工学院教授、博德研究所资深研究员张锋分别相继证明了CRISPR序

列与Cas9蛋白结合可以在人类细胞中高效地定位、剪切和修改基因组。

二、CRISPR/Cas9系统的作用机理

CRISPR/Cas9系统主要由Cas9蛋白和单链向导RNA（sgRNA）所组成，其中Cas9蛋白

起切割DNA双链的作用，sgRNA起向导的作用，在sgRNA的向导下通过碱基互补配对原

则，Cas9蛋白可对不同的靶部位进行切割，实现DNA的双链断裂。

（一）CRISPR高度可变的间隔区的获得

当有外源DNA人侵细胞时，Cas1和Cas2编码的蛋白会对该DNA进行识别，并在过程中

寻找到该DNA的PAM区域，CRISPR将以该PAM区域附近的DNA序列作为候选的原型间隔

序列。在识别后，Cas1/2蛋白复合物会对选择出的间隔序列进行剪切处理，同时，会有一部分

酶将原间隔序列插人到CRISPR序列的前导區下游区域。在通常情况下，断裂的DNA会采用

高效的非同源末端连接方式（NHEJ）进行自我修复，将被剪切的双链缺口闭合。经过该阶

段，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。

（二）CRIPSR基因座的表达

CRISPR序列的前导区会调控序列转录产生pre-CRIS-PRRNA，tracrRNA（反式激活

crRNA）在此时也会被转录出来与pre-crRNA序列进行互补。pre-CRISPRRNA通过碱基互补

配对与tracrRNA形成双链RNA并