蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告.pdfVIP

实验目的

1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况

2.学会用SDS电泳法分离不同分子量的蛋白质

3.学习通过亲和层析法化目的蛋白

4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质

实验原理

1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，

让其在中表达，该表达载体上含有操作子的启动子。在不诱导剂的

E.colilac

条件下培养宿主菌，基因表达的阻遏蛋白LacI与操作子结合，使外源基

lacIlac

因不能表达；向培养基中入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与

lac操作子结合，外源基因就表达。

2.蛋白质SDS电泳分离：SDS是最常用的定性分析蛋白质的电泳方

式，特别是用于蛋白质度检测和测定蛋白质分子量。其分离原理是根据蛋白质

分子量的差异，因为SDS的品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二

级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳

定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量

的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略

不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子

质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。

3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和

G-250两种类型。考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸

残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰

胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，

红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染

色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架

的表达产物是一个杂和蛋白。在E.coli的pET表达系统中表达N端含有His-tag

（组氨酸六聚体）的融合靶蛋白，然后用亲和层析的方法进行化。

多聚组氨酸能与多种过渡金属和过渡金属螯合物结合，因此带暴露的6XHis-tag

的蛋白质能结合于固化Ni2+树脂，从而将带有his-tag组氨酸标签的融合蛋白与

其它蛋白区分开来。组氨酸残基的五元咪唑环是蛋白与Ni离子作用的关键。当

我们用高浓度的咪唑（imidazole）溶液洗脱的时侯，咪唑便与融合蛋白his-tag的

咪唑环竞争结合，最终将融合蛋白洗脱下来。

5.蛋白质杂交法：蛋白质杂交也称Westernblotting，首先是要将电泳后分离的蛋

白从凝胶中转移到PVDF膜上，本实验使用电泳印迹湿转法。这种方法是用有孔

的塑料和泡沫将凝胶和NC/PVDF膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极

中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用

下离开凝胶结合到PVDF膜上。转移后PVDF膜就称为一个印迹（blot），用于对

蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液处理以封闭PVDF膜上剩余的疏水

结合位点，而后用一抗处理，待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合

物，清洗除去未结合的一抗，进一步用适当标记的二抗处理，带有标记的二抗与

一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置。

实验仪器与材料、试剂

1.实验仪器：超净工作台、试管、摇床、离心机、垂直板电泳仪、空气浴摇床、

低温离心机、电泳仪、超声破碎仪等。

2.实验材料：大肠杆菌BL21；重组质粒pET-X，PVDF膜

3.实验试剂：

（1）50mg/ml卡那霉素。

（2）1MIPTG：

（3）LB液体培养基

(4)蛋白质Marker

(5)30％Acr/Bis（丙烯酰胺溶液

(6)1.5MTris-HCl（pH8.8）：

(7)0.5MTris-Hcl（PH6.8）：

(8)10%（w/v）SDS（二烷基磺酸钠）溶液:

(9)10%AP（过硫酸铵溶液,AP

(10)TEMED：商品液。

(11)10X电泳缓冲液(12)

（13）1膜转移液(1000ml)：

（15）洗膜