酶工程酶的生产和分离纯化.ppt

过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20?～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透20?生物小分子、盐、离子反渗透膜第31页,共53页，星期六，2024年，5月膜分离加压膜分离微滤超滤反渗透电场膜分离电渗析离子交换膜电渗析扩散膜分离透析第32页,共53页，星期六，2024年，5月4、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数第33页,共53页，星期六，2024年，5月层析方法分离依据离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶过滤层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化4、层析分离第34页,共53页，星期六，2024年，5月离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换层析第35页,共53页，星期六，2024年，5月按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。第36页,共53页，星期六，2024年，5月凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶过滤层析第37页,共53页，星期六，2024年，5月凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。第38页,共53页，星期六，2024年，5月常用的凝胶： 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶第39页,共53页，星期六，2024年，5月亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。亲和层析第40页,共53页，星期六，2024年，5月酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.亲和层析第41页,共53页，星期六，2024年，5月根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为： 共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析第42页,共53页，星期六，2024年，5月5、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。第43页,共53页，星期六，2024年，5月5、电泳分离颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。第44页,共53页，星期六，2024年，5月5、电泳分离聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦第45页,共53页，星期六，2024年，5月SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）加入1%~2%的SDS制备而成。SDS－PAGE主要用于测定蛋白质的分子质量。基本原理：SDS－蛋白质复合物中SDS含有大量阴离子，从而掩盖了蛋白质之间原来的电荷的差异；而且蛋白质构象发生改变变成椭圆形，短轴为18埃左右，长轴与蛋白质分子质量成正比－－－SDS－蛋白质复合物的迁移率不再受其原在电荷和分子形状的影响，而只决定于蛋白质的分子质量。第46页,共