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一代、二代、三代基因测序技术
的发展历史及应用;目录
CONTENT;基因测序技术也称作DNA测序技术,即获得目的DNA片段碱基排列顺序的技术,获得目的DNA片段的序列是进一步进行分子生物学研究和基因改造的基础。;1977年,WalterGilbert和FrederickSanger发明了第一台基因测序仪,并应用其测定了第一个基因组序列,噬菌体X174,全长5375个碱基。WalterGilbert和FrederickSanger也因在测序技术中的贡献获得了1980年诺贝尔化学奖。
Sanger所发明的测序方法被称为第一代测序技术,该技术直到现在依然被广泛使用,但是其一次只能获得一条长度在700~1000个碱基的序列,无法满足现代科学发展对生物基因序列获取的迫切需求。;毛细管电泳技术的原理;完整的测序过程分为4步:
1.DNA变性,形成单链;
2.DNA聚合酶结合;
3.dNTP中混有低比例的ddNTP,得到不同位置终止的序列;
4.凝胶电泳获得序列:对得到的序列进行凝胶电泳,得到一张色谱图,根据碱基的顺序和位置确定序列信息。;BigDye直接循环测序试剂盒的测序步骤更少,操作时间更短,将PCR清洗和循环测序结合到一个步骤中,时间缩短40%。;仪器名称;第一代测序技术的应用:
PCR产物测序:对目的基因的PCR产物进行测序,得到目的基因序列;(如科研机构克隆拟南芥的某个基因)
重测序:突变、SNPs、插入或缺失克隆产物的验证;(如重组质粒的验证)
分型分析:微生物和真菌分类学鉴定、HLA分型、病毒分型等;(如某一株细菌的种属鉴定,扩增出16S)
临床应用:肿瘤突变基因的检测和肿瘤个体化治疗,致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传病检测;(如非小细胞肺癌EGFR检测、脆性X综合征的检测、天昊流产物无非整倍体检测、STR亲子鉴定)
对新一代测序技术的结果进行验证。;目录
CONTENT;二代测序;二代测序的技术平台——Roche/454;二代测序的技术平台——Roche/454;二代测序的技术平台——Roche/454;二代测序的技术平台——ThermoFisher
;二代测序的技术平台——ThermoFisher;二代测序的技术平台——ThermoFisher;二代测序的技术平台——ThermoFisher;二代测序的技术平台——ThermoFisher;二代测序的技术平台——Illumina/Solexa;靶向测序的建库策略:杂交捕获vs扩增子测序;二代测序的技术平台——Illumina/Solexa;二代测序的技术平台——Illumina/Solexa;二代测序的技术平台——华大智造;二代测序的技术平台——华大智造;二代测序的技术平台——华大智造;二代测序的技术平台——华大智造;二代测序技术的应用;目录
CONTENT;
2008年Helicos公司推出第一台单分子测序仪HeliScope,不过它的读长很短,只有30-50个碱基,尽管是单分子测序,但并没有形成市场影响力。
2011年,Pacbio公司推出了第一台RS单分子测序仪,不过Pacbio刚上市时虽然改善了读长,但是错误率很高,大约15%,主要是在早期没有成熟的算法、软件和数据库去矫正数据,所以很难真正去应用。2012年开发出新的算法,可以用二代测序数据去矫正三代测序的数据,后来又开发出可以用三代测序的数据去矫正三代测序,才把长序列变的比较准确。2019年Pacbio推出了Sequal系列测序仪,目前读长可以长达20kb。
2014年牛津纳米孔测序技术公司ONT推出了第一个纳米孔测序仪MinlON。读长超长,通量超大,产品最小可以做到U盘大小,特别适合在特殊环境下进行快速测序。
;三代测序--PacBio平台测序原理;—SMRTCell:包含成千上万个ZMW小孔的芯片,同时对大量单分子DNA测序。
—PacBioRSII仪器配套的Cell含有15万个ZMW小孔,通量为0.5~1Gb;
—PacBioSequel仪器配套的Cell含有100万个ZMW小孔,通量为5~10Gb;;三代测序--PacBio平台测序原理;注:经过改良的DNA聚合酶每秒合成3个碱基,确保光学系统能够捕捉到相应碱基释放的荧光信号;SequelII平台可提供CLRLibrary和CCSlibrary(HIFI)两种测序模式;Reader——跨膜蛋白,可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白,具有天然的蛋白纳米孔。经过基因改造得到Reader。
Membrane——多聚物薄膜,Reader蛋白会被嵌入到高电阻率的由人工合成的多聚物膜中,膜两侧是离子溶液,在两侧加不同的电位,离子就会在孔中流动,形成电流。
Motor——
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