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聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白

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掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理；

学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳操作技术；

了解血清蛋白主要成份。

一、试验目标

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二、试验原理

不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品经过浓缩胶浓缩按分子大小排列成层，然后进入分离胶，伴随电泳不停进行，不一样大小、电荷蛋白质分子逐步被分开。

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Bis将单体长链连成网状结构

TEMED催化AP生成硫酸自由基

1、聚丙烯酰胺凝胶生成

催化Acr聚合成长链

Acr：丙烯酰胺

Bis：甲叉双丙烯酰胺

AP：过硫酸胺（催化剂）

TEMED：N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（加速剂）

Acr、Bis决定孔径大小

AP、TEMED决定聚合速度

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连续胶电泳

采取相同孔径凝胶和相同缓冲系统（样品缓冲液、凝胶缓冲液

和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度相同条件下进行。

优点：

制胶简单、快捷

缓冲液pH值恒定，能够预防样品进胶后因pH值改变发生凝聚和沉淀

缓冲系统组成简单，起源广泛

缺点：

分辨率不高

2、连续胶和不连续胶电泳

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不连续胶电泳

采取不相同孔径凝胶和不一样缓冲系统电泳方式，在电泳分离过程中，由

于浓缩胶堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带，然后

在一定浓度或浓度梯度凝胶上进行分离。

优点：

分辨率高

用于复杂和特殊样品分离

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不连续电泳三种物理效应

样品浓缩效应

凝胶分子筛效应

电荷效应

电泳过程三种效应同时存在，对蛋白样品起协同作用，使样品各组分按照带电量、分子质量及形状按一定次序分离。

不连续电泳四种不连续体系

凝胶不连续

缓冲液成份不连续

缓冲液pH值不连续

电压梯度不连续

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三、试验步骤

封槽

清洁、干燥小玻管一端，用Parafilm贴封后垂直放在管架上

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分离胶：A:C:D:E＝1:2:3:2（V/V）

浓缩胶：B:C:D:E＝2:1:5:2（V/V）

A:pH8.9Tris/Hcl缓冲液

B:pH6.7Tris/Hcl缓冲液

C:30%Acr-Bis贮存液

D:水

E:过硫酸铵灌装前加入TEMED，混匀

取洁净玻璃管，下端封口膜封好（主要）；用注射器加分离胶至管口1-2cm处，封水（沿管壁，动作要慢）；凝固后弃水、吸干；加浓缩胶距管口2-3mm处、封水；凝固后备用。

制胶和灌胶

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加样

用微量注射器取样品液15μl，针头伸入玻璃管上口，沿壁加在浓缩胶面上，迟缓注入。

电泳

连接电极，上负下正；

浓缩胶：3mA／管，分离胶：4mA／管；

待示踪染料靠近凝胶管底部约0.5cm处，切断电源。

剥胶

取下凝胶管，用注射器吸收一定量蒸馏水，将针头插入胶柱-与管内壁之间，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分离，然后用洗耳球轻轻在玻管一端加压，使凝胶柱从玻管迟缓滑出，将凝胶柱置于洁净试管内，用蒸馏水冲洗几次。

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染色

将凝胶柱置于0.05%氨基黑10B溶液中浸染20min，然后再浸入7%醋酸溶液中脱色。

血清蛋白在凝胶柱上可分出十多条色带。

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