DB46T 220-2012 槟榔苗黄化病植原体PCR检测技术规范.docxVIP

ICS65.020B16

备案号：33827-2012DB46海南省地方标准

DB46/T220—2012

槟榔苗黄化病植原体PCR检测技术规范

TechnicalspecificationforPCRdetectionofarecanutyellowleafphytoplasmaofseedling

2012-04-18发布2012-05-18实施

海南省质量技术监督局发布

I

DB46/T220—2012

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由海南省质量技术监督局提出。

本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。

本标准主要起草人：罗大全、车海彦、温衍生、徐雪莲。本标准首次发布于2012年4月。

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DB46/T220—2012

槟榔苗黄化病植原体PCR检测技术规范

1范围

本标准规定了槟榔苗黄化病植原体的检测技术规范。本标准适用于槟榔苗中槟榔黄化病植原体的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。3.1

Ct值

指荧光信号有统计意义显著增长（即穿过阈值线）时的循环次数。3.2

槟榔苗

用成熟种果育成的实生苗，育苗时间在两年以内的苗。

4原理

以染色体DNA为基础的分子生物学技术已用来检测和鉴定植原体。根据16SrRNA基因保守序列设计通用引物，应用巢式PCR（nested–PCR）技术检测。根据16SrRNA基因序列设计翠菊黄化组（16SrⅠ组）植原体特异性引物/探针组合，进行实时荧光PCR的检测。

5仪器设备

台式高速冷冻离心机（最高转速在12000rpm以上）、全自动数码凝胶图像分析系统、PCR仪、全自动荧光定量PCR系统、全自动灭菌器、电子分析天平（万分之一）、旋涡混合器、水平电泳装置，微量可调移液器（0.1-1000μL)。

6试剂和缓冲液配制

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DB46/T220—2012

用于巢式PCR和实时荧光PCR检测的试剂和缓冲液配制，参见附录A。

7检测方法

7.1槟榔心叶总DNA提取

称取抽样的槟榔植株刚抽出的心叶0.5g，加入适量液氮研磨呈粉状，再加入1mLDNA提取缓冲液充分研磨，然后加入80μL10%十二烷基肌氨酸钠，混匀，在55℃温育1~2h，4℃6000rpm离心10min，取上清液；加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻轻混匀，-20℃保持至少30min，4℃8000rpm离心15min，弃上清；加入600μLTE缓冲液、30μL10%十二烷基硫酸钠和12μL蛋白酶K（5mg/ml），轻轻彻底悬浮沉淀，37℃温育30-60min；加100μL5MNaCl混匀，再加入84μLCTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育10min；加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）混匀，4℃6000rpm离心5min，重复直至无中间白色层；取上清液，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，4℃6000rpm离心5min；取上清液，加入2/3体积异丙醇，混匀，-20℃保持至少30min，4℃12000rpm离心10min，弃上清液；加入500μL70%乙醇洗涤，4℃12000rpm离心10min，洗涤两次；取沉淀，加入50μLTE混匀溶解。加入5μLRNaseA(10μg/μl)，37℃30min,除去RNA。

7.2巢式PCR检测

下述反应均需同时设植原体16SrDNA质粒作为阳性对照，设经确认的健康槟榔植株叶片作为阴性对照，设灭菌双蒸水作为空白对照。

7.2.1引物序列

引物采用植原体16SrDNA通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，引物序列见表1。表1巢式PCR检测的引物序列

引物名称

引物序列5’-3’

R16mF2

CATGCAAGTCGAACGGA

R16mR1

CTTAACCCCAATCATCGAC

R16F2n

ACGA