标记免疫反应定量分析技术常用类型.ppt

光电倍增管高压高速放大器高速比较器高速分频器发光样品产生光子激发光阴极产生光电子在阳极上形成较强信号脉冲信号相对发光单位数字脉冲(RLU)在各打拿极之间得到能量和数目的倍增单光子计数器发光分析仪的核心部件高灵敏度分类基本原理标记物底物特点直接化学发光免疫分析用电化学发光剂（吖啶脂）直接标记抗体（抗原），与待测标本中的抗原（抗体）发生免疫反应后，在H2O2和NaOH作用下，吖啶脂分解发光，发光量与抗原量成正比吖啶酯等H2O2，NaOH发光速度较快，反应体系简单；化学发光剂比酶类标记物更稳定，不受酸碱和温度影响，试剂保存期更长化学发光酶免疫分析酶标记抗体（抗原），与待测样本中相应抗原发生免疫反应，之后将化学发光剂作为反应底物，在酶的催化下发射光信号碱性磷酸酶AMPPD，鲁米诺发光剂酶类催化底物，发光速度略慢；易受酸碱度和温度影响。电化学发光免疫分析该方法是以电化学发光剂标记抗体（抗原），在电场中转移电子而发生特异化性化学发光反应三联吡啶钌三苯胺包含电化学和化学发光两个过程，较复杂，发光连续；有交叉反应，携带污染风险化学发光免疫分析法比较镧系元素中的铕（Eu）、钐（Sm）、铽te（Tb）、镝di（Dy）、铌(Nb)能发射离子荧光，标记蛋白质多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，在紫外光激发下，产生持续一定时间、一定光峰的荧光。其它非特异荧光寿命很短，待其衰减后，用特别的TRF仪测定最后产物中镧系元素的特异荧光强度，根据荧光强度比值来判断反应体系中被分析物质的浓度，达到定量分析的目的。时间分辨荧光分析法体外标记免疫分析临床应用体外分析测定:蛋白质、激素、药物、肿瘤标志物、病毒抗原等稳定性核素标记技术在临床中的运用13C呼气试验尿素13C呼气试验（UBT）是最快速、最便宜的确认幽门螺旋杆菌（HP）感染的非创伤性试验，是目前全球公认的抗HP治疗后HP是否根除的最为准确的方法，无需胃镜复查。其敏感性和特异性分别高达90-95%和95-98%。同位素13C无放射性，安全准确，无交叉感染，对环境无污染。原理：正常人胃内没有尿素酶，不能分解尿素，如果感染HP，则HP能分泌尿素酶，把带示踪标记（13C）的尿素分解成NH3和13CO2，收集肺排出的13CO2进行检测就能判断是否感染HP质谱仪工作原理以离子源、质量分析器和离子检测器为核心。离子源是使试样分子在高真空条件下离子化的装置。电离后的分子因接受了过多的能量会进一步碎裂成较小质量的多种碎片离子和中性粒子。它们在加速电场作用下获取具有相同能量的平均动能而进入质量分析器。质量分析器是将同时进入其中的不同质量的离子，按质荷比离子依次进入离子检测器，采集放大离子信号，经计算机处理，绘制成质谱图**第三章

标记免疫反应定量分析技术常用类型第一节放射性核素标记免疫分析技术1.1960年美国的Berson和Yalow将核技术与免疫学技术相结合建立了放射免疫分析法2.首先用于测定血浆胰岛素浓度3.该法对医学的巨大贡献，1977年Yalow获得了NobelPrize。YalowBersonRadioimmunoassay（RIA）1、RIA原理同竞争法免疫反应，利用放射性核素标记抗原（*Ag）和待测抗原（Ag）与同一有限的特异性抗体（Ab）竞争性结合2、IRMA（Immunoradiometricassay）原理IRMA是将放射性核素标记在抗体(*Ab)上，待测抗原与过量的*Ab进行非竞争性免疫结合反应，形成抗原-标记抗体复合物*Ab-Ag及游离的*Ab。测定的对象是抗原-标记抗体复合物。待测抗原的浓度与Ag-*Ab的量呈正相关。IRMA最典型的反应模式是夹心法125I：为电子俘获衰变，放出γ射线（35.5Kev）和特征X射线（27Kev）T1/2=60.2天有利于125I标记化合物的商品化，广泛应用于体外放射分析中常用标记核素：125IRIA、IRMA基本操作五步骤1、加样2、温育3、分离B与F4、测量样品放射性5、数据处理（标准曲线、查待测物含量）1、双抗体法；2、聚乙二醇（PEG）法3、固相分离法基本试剂标准品（Ag）标记物抗体分离剂常用的分离技术试剂盒聚乙二醇（PEG)沉淀法◆溶液中的蛋白质分子因表面因具有电荷层及水化层而不易沉淀。◆当反应液pH值处于γ球蛋白等电点时，加入适当浓度的聚乙二醇(PEG)以其吸水作用使蛋白质脱水，致γ球蛋白(包括B)沉淀，从而使B与F分离。◆优点：操作简