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用以检测突变的方法与引物组的制作方法
用以检测突变的方法与引物组的制作方法
在此揭示以聚合酶链式反应(polymerase?chain?reaction,
简称PCR)为基础的方法,此方法可用以检测样本中目标基因
之一所选区域中是否发生插入/缺失变异(相较于一参考序
列)。目标基因具有一模板股与一编码链。此方法运用包含
一抑制引物以及一正向引物的引物组。所用的抑制引物与正
向引物部分序列重叠,但具有不同的解链温度,且抑制引物
的3’端经修饰而能够防止抑制引物在PCR过程中延伸。因
此,在特定的PCR条件下,能检测到PCR产物意味着在所选
区域中发生了插入/缺失突变,而未检测到PCR产物意味着
在所选区域中并未发生插入/缺失突变。
【专利说明】用以检测突变的方法与引物组
(1)
【技术领域】
[0001]本发明是关于用以检测变异的方法与引物组。具体
来说,本发明是关于插入和/或缺失变异的检测。
(2)
【背景技术】
[0002]基因突变(genemutat1n)系指一特定基因或调控序
列的核苷酸序列相较于天然(或正常)核苷酸序列有所改变。
突变可以是点突变(pointmutat1n;即,单一核苷酸置换)、
一或多个核苷酸的缺失(delet1n)或插入(insert1n)、多个
核苷酸的置换(substitut1n)或在染色体层级的互换
(crossing-over)。
[0003]近年来,用以检测点突变或染色体互换的技术发展
迅速。举例来说,可利用桑格式直接测序法(Sanger’s
directsequencing)来对目标序列测序,以得知发生突变的
一或多个核苷酸。然而此种直接测序的灵敏度不高,因而限
制了此技术在临床与研究领域等的应用。或者是可采用专一
的引物和/或探针,以正向检测目标序列上的点突变或互换。
然而,运用上述方法来检测插入突变与缺失突变的相关报导
并不多见。传统上,在设计用以检测插入/缺失突变的引物
或探针时,必须先知道突变部位的序列。当目标基因中带有
超过一个的插入和/或缺失核苷酸时,必须使用多个引物才
能确保所有突变序列都能被检测。此外,传统方法极易发生
检测错误,部分是因为以引物或探针和目标基因进行杂交
(hybridizat1n)时,突变部位可能形成环圈(loopedout),因
此引物或探针仍可和具有突变核苷酸之目标基因发生非特
异性的杂交(unspecifichybridizat1n)。更有甚者,这些习
知检测方法之检测灵敏度(detect1nsensitivity)通常较低,
因而需要使用大量的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,
简称DNA)和/或经过更多次的反应循环,使得整个反应耗时
费力。在某些情形中,必须使用实时定量聚合酶链式反应
(real-timequantitativepolymerasechainreact1n,简称
RTQ-PCR)和/或RTQ-PCR专用的设备才能够进行检测。因而,
为了确保得到正确的检测结果,习知方法可能需要花费较多
时间或成本来优化反应参数。以上种种因素限制了这些技术
在临床试验以及基础研究等领域的应用。
[0004]有鉴于上述问题,相关领亟需提出一种能够正确地
检测插入和/或缺失突变的方法。
(3)
【发明内容】
[0005]
【发明内容】
旨在提供本揭示内容的简化摘要,以使阅读者对本揭示内容
具备基本的理解。此
【发明内容】
并非本揭示内容的完整概述,且其用意并非在指出本发明实
施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。
【发明内容】
旨在提供本揭示内容的简化摘要,以使阅读者对本揭示内容
具备基本的理解。此
【发明内容】
并非本揭示内容的完整概述,且其用意并非在指出本发明实
施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。
[0006]本发明至少部分是基于一种新颖的引物设计方案,
此种设计方案使得样本中,带有变体序列(相较于参考序列)
的目标基因能够被扩增,且因而能够检测到此种具有突变的
目标基因。具体来说,所述目标基因具有模板链以及和此模
板链互补的编码链,而本发明提出的引物组及方法是针对该
模板链中一段选定区域来进行设计。此处所述的选定区域可
能带有或不带有至少一变异核苷酸,此变异核苷酸可能是被
插入到参考核苷酸序列中,或自参考核苷酸序列中被移除。
于一实施例中,参考序列可为野生型(正常)序列,此时变体
序列可带有插入和/或缺失突变
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