自学内容基因工程基本操作专家讲座.pptx

第六章

基因工程主要操作原理自学内容基因工程基本操作专家讲座第1页

-9-24基因工程基本操作2第一节DNA提取（一）总DNA提取大肠杆菌总DNA提取植物总DNA提取动物总DNA提取质粒DNA提取噬菌体DNA提取自学内容基因工程基本操作专家讲座第2页

-9-24基因工程基本操作3DNA应用：构建基因组文库：100kbSouthern杂交(包含RFLP)：50kbPCR分离基因等：50kb自学内容基因工程基本操作专家讲座第3页

-9-24基因工程基本操作4因“材”施提依据不一样研究需要，确保结构对应完整性尽可能排除其它大分子成份污染(蛋白质、多糖及RNA等)确保提取样品中不含对酶有抑制作用有机溶剂及高浓度金属离子在DNA提取过程中应做到自学内容基因工程基本操作专家讲座第4页

-9-24基因工程基本操作51.大肠杆菌总DNA提取机械裂解化学裂解：溶菌酶orEDTAorboth,SDS去蛋白：酚/氯仿抽提浓缩：乙醇，加单价阳离子，如Na+储存：-20℃放置自学内容基因工程基本操作专家讲座第5页

-9-24基因工程基本操作6自学内容基因工程基本操作专家讲座第6页

-9-24基因工程基本操作7操作步骤100mL细菌过夜培养液,5000rpm离心10分钟,去上清液。加9.5mLTE悬浮沉淀,并加0.5ml10%SDS,50μl20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K,混匀,37℃保温1小时。加1.5mL5mol/LNaCl,混匀。加1.5mLCTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20分钟。用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心10分钟,将上清液移至洁净离心管。用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至洁净管中。加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟，沉淀DNA。用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗后,吸干,溶解于1mlTE,-20℃保留。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心,使DNA沉淀。自学内容基因工程基本操作专家讲座第7页

-9-24基因工程基本操作82.植物细胞总DNA提取总标准：取材液氮研磨裂解去蛋白和细胞物浓缩自学内容基因工程基本操作专家讲座第8页

-9-24基因工程基本操作9（1）CTAB法CTAB(cetyltriethylammoniumbromide)(十六烷基三乙基溴化铵)一个去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶，当降低溶液盐浓度到0.3mol/LNaCl时，从溶液中沉淀。高盐提取---低盐沉淀---高盐溶解---乙醇沉淀自学内容基因工程基本操作专家讲座第9页

-9-24基因工程基本操作10经典CTAB法使用两种缓冲液高盐提取缓冲液：1％（冷冻干燥材料）或2％CTAB（新鲜材料）、0.7mol/L或1.4mol/LNaCl沉淀缓冲液：1％CTAB，不含NaclCTAB法优点能很好地去除糖类杂质对于含糖较高材料可优先使用在提取前能同时得到高质量DNA及RNA。可依据需要分别进行纯化，如只需要DNA，则可用RNase（核糖核酸酶）水解掉RNA。自学内容基因工程基本操作专家讲座第10页

-9-24基因工程基本操作11(2)SDS法利用高浓度SDS，在较高温度(55～65℃)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采取提升盐浓度及降低温度作法使蛋白质及多糖杂质沉淀(最惯用是加入5mol／LKAc于冰上保温，在低温条件下KAC与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中DNA用酚／氯仿抽提，重复抽提后用乙醇沉淀水相中DNA。自学内容基因工程基本操作专家讲座第11页

-9-24基因工程基本操作12SDS法优缺点优点：SDS法操作简单、温和，也可提取到分子量较高DNA。缺点：产物含糖类杂质较多。该方法所得DNA样品也可直接用于Southern杂交，但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并适当延长反应时间。自学内容基因工程基本操作专家讲座第12页

-9-24基因工程基本操作133.动物细胞总DNA提取取材液氮研磨裂解：SDS和蛋白酶K去蛋白和细胞物浓缩自学内容基因工程基本操作专家讲座第13页

-9-24基因工程基本操作14操作步骤切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。加1mL10%SDS,混匀,此时样品变得很粘稠。加50μl或1mg蛋白酶K,37℃保温1-2小时,直到组织完全解体。加1mL5mol/LNaCl,混匀,5000rpm离心数秒钟。取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异