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第三章核酸操作基本技术

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3.1碱抽提法提取DNA

碱变性抽提法又称碱抽提法或碱裂解法，是一个用最广泛制备质粒DNA方法，是当今分子生物学研究中常规方法。碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性差异而到达分离目标。在pH值到达12.6碱性条件下，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状两条互补链不会完全分离。当以pH4.8NaAc高盐缓冲液调整其Ph至中性时，变性质粒ＤＮＡ又恢复原来构型，保留在溶液中，而染色体ＤＮＡ不能复性

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而形成缠连网状结构。经过离心，染色体ＤＮＡ与不稳定大分子ＲＮＡ、蛋白质－ＳＤＳ复合物等一起沉淀下来而被除去。

碱变性抽提质粒ＤＮＡ，除了菌体培养、质粒扩增和搜集菌体外，其提取过程大致分为三个步骤：（１）从染色体ＤＮＡ中分离质粒ＤＮＡ。（２）去除质粒ＤＮＡ中ＲＮＡ。（３）深入纯化质粒ＤＮＡ，去除蛋白质等杂质。

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3.1.1碱抽提法所用各类试剂生化作用

（１）溶菌液中溶菌酶是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁主要化学成份肽聚糖中Ｂ－１，４糖苷键，因而含有溶菌作用。

（２）NaOH-SDS液：核酸在pH５.９溶液中是稳定，但当pH１２或pH３时，就会引发双链之间氢键解离而变性。ＳＤＳ是离子型表面活性剂，它能够溶解细胞膜上脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚

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细胞中核蛋白，还能与蛋白质结合成为Ｒ－Ｏ－ＳＯ－３…R+－蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。不过ＳＤＳ能抑制核糖核酸酶作用，所以在以后提取过程中，必须把它去除洁净，预防它影响Raase活性。

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（３）ＮaＡc水溶液呈碱性，为了调整pH至4.8，必须加入大量冰醋酸。目标是把pH12.6抽提液调整至中性，使变性质粒ＤＮＡ能够复性，并能稳定存在。而高盐３mol/LNaAc有利于变性大分子染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、以及ＳＤＳ－蛋白复合物凝聚而沉淀之。

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（４）乙醇：ＤＮＡ溶液是ＤＮＡ以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去ＤＮＡ周围水分子，ＤＮＡ失水而易于聚合。普通试验中，是加２倍体积无水乙醇与ＤＮＡ相聚合，其乙醇最终含量占６７％左右。

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（５）ＴＥ缓冲液：在基因操作试验中，选择缓冲液主要标准是考虑ＤＮＡ稳定性及缓冲液成份不产生干扰作用。采取Tris-HCL缓冲系统，因为缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子干扰作用，故在提取或保留ＤＮＡ时，大都采取Tris-HCL系统，而ＴＥ缓冲液中ＥＤＴＡ更能稳定ＤＮＡ活性。

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（６）酚－氯仿：酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质密度比水密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中ＤＮＡ分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

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（７）异戊醇：在抽提ＤＮＡ时，为了混合均匀，必须猛烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止分子相互间充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能降低抽提过程中泡沫产生。普通采取氯仿与异戊醇之比为２４：１。也可采取酚、氯仿与异戊醇之比为２５：２４：１。同时异戊醇有利于分相，使离心后上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

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（８）饱和酚：因为酚与水有一定互溶，苯酚用水饱和目标是使其抽提ＤＮＡ过程中，不致吸收样品中含有ＤＮＡ水分，降低ＤＮＡ损失。用Ｔris调整pH为８是因为ＤＮＡ在此条件下比较稳定。

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质粒DNA小规模提取－碱裂解法

1）接种一单菌落于3ml含70μl/mlAmpLB液体培养基中。200转/分37℃振荡培养过夜（约8－10h）。1rpm离心1min搜集细菌。

2）用STE重悬细菌沉淀，1rpm离心5min，弃上清。

3）将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷溶液I中，加入200μl新配制溶液II，温和转动使之混匀，冰浴2min。

4）加入150μl溶液III，将管倒置摇荡1min，冰浴5min。

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质粒DNA提取溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris.Cl（pH8.0），10mMEDTA（pH